大鼠灌注固定取脑 ppt课件

大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。

2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。

3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。

小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。

4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。

5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。

时,剪开右心耳,使血液排出。

观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。

固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。

7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。

8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。

首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。

大、小鼠灌注固定的方法准备物品：1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺）2、医用输液器3、500ml输液用玻璃瓶4、血管钳5、剪刀6、生理盐水7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。

左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。

取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。

多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。

如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。

如此灌注约需1小时时间。

充分暴露升主动脉套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。

2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。

相对来说，剪开右心耳更为方便。

我们就是这样做的。

3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。

另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。

4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。

有条件的话可加点肝素。

5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。

先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。

小鼠灌注固定方法：采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20 mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20 mL 生理盐水。

推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。

大鼠灌注取脑流程一、麻醉10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射二、开胸1、沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉。

2、用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏。

三、穿刺将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键，也是难点。

1、首先准确找到主动脉，这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净，用眼科镊子轻轻夹住心外膜（夹的越少越好，以免影响取材）将心脏向左上方提起（剪开心包壁层的前壁，暴露升主动脉和肺动脉干的根部）。

2、穿刺之前要用适当大小的血管钳夹住心室以固定心脏，但不要夹得过紧，要让心腔内留有一定的间隙。

用小剪刀在心尖处先剪开一个小口，再插入穿刺针。

3、插入时动作要慢，针尖方向不要偏向右侧，以免刺入右心房，如果感到有阻力，则将针退后、调整方向重新进针，直到进入主动脉，灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置，灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米，然后用丝线扎紧。

4、灌注针插入成功后，用小剪刀剪开右心耳。

四、灌注1、用量（夹闭腹主动脉）4℃生理盐水（50-100ml/只），4℃的4%多聚甲醛（50-100ml/只）2、速度先快后慢，共用30分钟左右3、成功标志生理盐水：右心耳流出液体血色较浅基本澄清，肺脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。

多聚甲醛：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

五、取脑1、枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨。

2、用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉。

3、用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

六、保存取出的整个脑组织块再置于4%多聚甲醛4℃保存。

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注取脑大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

大鼠灌注固定取脑大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。

2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。

3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。

小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。

4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。

5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。

时,剪开右心耳,使血液排出。

观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。

固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。

7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。

8)保存或切片注意事项：1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。

首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。

大鼠灌注取脑1.用于常规HE 染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot 和PCR 。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或者其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

1.脑组织较软，且细胞成份不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE 染色后，可去除红细胞背景影响。

1) 麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或者切片.大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4% 多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24 小时。

1.多聚甲醛的配置：普通方法为：4％多聚甲醛PBS 缓冲液配法：称取40g PFA 溶于装有500mlDEPC 水的玻璃容器(烧杯或者烧瓶)中，持续加热磁力搅拌至60 ~ 65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L 的NaOH 值至7.4，使呈清澈状(滴加)，再加入约500ml PBS，充分混匀(在冰浴或者冷水浴中)，可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或者4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS ，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或者温箱密封放置2 天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA 溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2。

冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR.4。

如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时,不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果.原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法.多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性:1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一,血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤.3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响.大鼠灌注取脑标准操作规程（SOP):流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4）生理盐水冲水 5)4％多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片。

具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上，置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏，经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳，先灌注冰冻无菌生理盐水（4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃）4％多聚甲醛XmL，断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips:1。

多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶)中，持续加热磁力搅拌至60～65℃,使成乳白色悬液。

用1。

0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS,充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml,室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急,55℃水浴一天,期间不时震荡。

大鼠灌注取脑大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。