苛氧菌痰涂片

压片法制备痰涂片压片法1：压片法2：压片法3压片法4火焰加热（再拉片）压片后的效果：染色效果（厚薄适宜、均匀一致）：镜下效果（单层细胞，胞浆明显，被吞噬细菌可见）注意事项：1.痰不要太多，一环足以；2.加热要适中，避免烫伤；3.压片、拉片用力要适中、均匀，不可用力过猛，避免玻片断裂划伤手如果是很粘稠的痰：用无菌杯盖子切割一小块（绿豆大小）。

或者加入少许L-半胱氨酸盐酸盐固体药粉0.1g 左右至痰杯中，加入10ml盐水，震摇溶解，置35℃30min后再挑取，就不粘稠了。

如何洗痰：把里面的痰用接种钩挑到一个无菌痰杯中，加入30ml左右的生理盐水，盖严盖子。

用手大拇指、食指、中指持痰杯使用手腕部的力量带动痰杯，用力震摇—→打开另一个无菌痰杯，注入30ml灭菌盐水准备好—→使用接种钩挑起最脓的部分到被子边缘，用被盖将该部分痰块切割下来—→将切下的痰块放入准备好的杯中再次震摇洗涤（如果担心震出液体污染台面可以使用涡旋混匀器，要相对安全些）—→重复上述步骤2~3次即可——挑出最脓的部分（约绿豆大小）用被盖切下，放在清洁载玻片上，使用另一个清洁载玻片将痰块压在中间，向右水平移动上面的玻片，将痰块压成玻片—→在酒精灯或者电热灭菌器前方轻轻烤烤涂膜—→将下面的有涂膜的玻片调换方向后再次压片拖片—→一张薄而均匀的痰片制成！处于生物安全的考虑，洗痰是必须在ⅡB2的生物安全柜内进行的。

否则，被结核杆菌感染就得不偿失了。

洗痰后的痰块必须要用胰酶或N-乙酰-L半胱氨酸消化降解后才容易接种，否则胶冻状粘稠的痰块很难被接种环划开。

压片法的手法很重要，相关详细的叙述在前面的帖子中有的，再仔细读读。

为了避免痰块被上面的推片给带走，下面盛痰块的玻片在压片制备前需要在酒精灯上烤烤，这样下热上冷两张玻片压住痰块时痰块就不会粘到上面去了。

另外，就是用于压片法制备涂片的痰块一定不能多了，最多就如绿豆大小即可，多了反而不妙。

痰涂片标准化操作
普仁医疗集团 无锡市第五人民医院检验科 刘君
主要内容
标本收集与运送
抗酸菌涂片 Ziehl-Neelsen 染色 显微镜读片检查 结果登记与玻片保存 抗酸菌涂片检查假阳性及假阴性的可能因素
标本收集与运送
提纲
标本容器 标本编号 收集方法与运送注意事项 标本的质量评价
假阴性的原因
1）观察涂片的视野数量不足 2）镜检技术能力差 3）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色 暗淡、背景太淡或过深） 4）显微镜存在问题 5）染液质量差
假阴性导致的结果
结核病人没有得到正确诊断和治疗， 向其他人传播疾病，或者死亡 随访病人缩短了应有的治疗时间
AFB假阴性结果的预防措施
确认标本是痰、而非唾液。 确认每份标本至少有1 ml。 选择脓样、干酪样、粘液痰涂抹制备玻片。 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 使用高质量染料、按照配方配制染液。
次日清晨留取的痰
*如果规划指南有所调整，请依据指南调整
用于疗效监测的随访标本
随访标本 (在治疗期间和结束的时候收 集)
晨痰 另外一份标本依据 NTP 指南进行收
集
标本收集
安全意识: 患者比标本有危险!
如果有实验员指导监督病人留痰，那么 他面临的危险要远高于其他实验员
痰标本收集的生物安全
2. 痰标本来源：根据患者做痰检查时的情况，选 择1栏填写。初诊患者填写门诊序号，随访患者填 写患者登记号。
3. 性状：标本性状按照国家实验室质量控制新标 准，分为干酪痰（A）、血痰(B)、粘液痰(C)和唾 液(D)，分别按A、B、C、D分类登记。
填写说明：
4. 结果：涂片阳性者使用红笔记录为“数字+”， 如“1+、2+、3+”，300个视野内仅见1～8条抗酸 杆菌者填写“条数”；阴性结果填为“阴性”， 不能记录为“-”或“（-）”。

结核杆菌痰涂片镜检的意义及其应注意的问题需知结核杆菌，是人类结核病的病原菌。

结核杆菌是专性需氧菌，无鞭毛，有荚膜，没有运动能力，典型的结核杆菌的形态为细长稍弯曲或直的、两端圆钝的杆菌，长1μm～4μm，宽0.3μm～0.6μm。

痰涂片经过抗酸染色阳性的标本，在100倍的生物显微镜下可在蓝色背景下看到紫红色的杆状菌，呈单个散在，有时也呈X、Y形或条索状、聚集成簇等。

痰涂片经金胺“O”染液染色后，在含有紫外光源的荧光显微镜下发出橘黄颜色，高倍镜（物镜40倍目镜10倍）下，可见结核杆菌产生黄绿色荧光，呈杆状或分枝状。

目前基层实验室多采用抗酸染色镜检。

（一）结核杆菌痰涂片镜检的意义1.诊断传染性肺结核结核病的控制是以发现和控制传染源为主，而痰涂片镜检阳性的肺结核患者是社会上最主要的传染源，故痰涂片镜检结果对诊断传染性肺结核具有重要意义。

2.评价化疗效果结核病是由结核杆菌引起的，针对结核病的治疗，现行化疗方案的制定也主要是以结核杆菌的生物学特性为依据，所以痰涂片镜检结果可以作为化疗效果的评估依据。

1.为流行病学疫情评价服务由于传染性肺结核在流行病学中有着特殊的意义，因此，涂阳患病率、涂阳发现率是反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的重要指标。

根据世界卫生组织（WHO)和国际防痨及肺部疾病联合会（UNION）针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制定的技术指南，痰涂片镜检是相应国家开展结核病控制项目时非常符合成本效益原则的细菌学试验技术。

相对于临床和实验室经常采用的其他诊断和检查项目，高质量的痰涂片镜检有其自身特殊的优势：作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高；技术相对简单，操作容易标准化；建立结核杆菌检查室设备投入少；检查成本低，易于接受；从收到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要；对涂阳患者的治疗效果，能够作出及时和准确的评价。

（二）结核杆菌痰涂片镜检应注意的问题1.实验室布局原则结核杆菌检查需要有独立的实验室，不能和其他实验室混用；染液配置、镜检等相对洁净的操作与标本存储、涂片、染色等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行，中间通过传递窗连接；基层实验室若只从事涂片镜检的，在只拥有一间独立房舍的情况下，相对洁净区与污染区也要有明显区分。

细菌 室每 天都 会接 收 大量 的培 养标 本 ，而 痰标 本 则 是大 多数 浅 ， 显微 镜 下所处 焦距 位置 与 中性粒 细胞 的胞 核在 同一 个层 面上 。 细菌 室每 天接 触 最多 的 。痰标 本受 口腔正 常 菌群 以及 定植 菌 的 污 ２ ． ２ ＿ ２ 细菌 粘 附的镜 下特 征 ： 细 菌 菌体 位于 白细胞 的边 缘或 其 上方 ，
染机 会 极 大 ， 相对 其 他标 本 来 说 ， 培 养 结果 的准 确性 无 法 保证 ， 确 且菌 体着 色 情况 与 白细 胞外 的细 菌完 全 一致 ，菌 体所 处 的 焦距 位 认致 病 菌 的难度 也更 大 。如 何才 能将 真 正 的致病 菌从 众 多 的培 养 置与 白细胞 的胞 核 处于不 同层 面 。 菌 中找 出来 呢 ？这对 于 细菌 室 的每一 位 工作 人员 来说 都 是一 项 棘 ２ ． ２ － ３ 对 于有 特殊 结构 的细 菌 的 白细胞 内吞 噬 与粘 附 的辨别 ：① 菌 手 的问题 。 体结 构 巨大 而超 过 白细 胞吞 噬能 力 的病 原体 ，例 如 出芽 的 真菌 孢 细菌 室 收到 痰标 本 的首 要任 务是 肉眼筛 选 ：将 肉 眼筛选 明显 子或 者 菌丝 。若其 为 致病 菌 ， 一般 为 多细 胞协 作 ， 即多 个 白细胞 融 不合 格 的标 本如 泡沫 样 唾液 、 口水 、 有 食 物残 渣或 标 本外 观 泄漏 等 合成 团 ， 将孢 子 及菌 丝 团团 围住 ， 分别 攻 击菌 体 的不 同部 位 。但 如 的标 本 直接退 回。将 肉眼筛 选合 格 的标 本 如脓 痰 、 干 酪痰 、 血痰 、 黏 果 出现类 似 白细 胞 内吞 噬 的现象 多数 为 黏 附 。② 菌体 有 荚膜 的细 液痰 等 接种 、 培养， 同时 涂片 。值 得强 调 的是 涂片 的 阅片 工作 与培 菌 ， 例如 肺炎 链球 菌 。感 染早 期 ， 菌体 外 的荚 膜可 有效 抵 御 白细 胞 养 同等 重 要 ，不 可 忽视 ，只有二 者相 互 结合 才 能找 出 真正 的病原 的吞 噬 ， 白细胞 无法 吞 噬菌 体 ， 此 时易形 成 细菌 与 白细胞 伴 行 现象 菌 。人体 呼 吸道被 致病 菌感 染后 ， 最 主要 的反应 是 白细胞 特别 是 中 （ 此 菌体 在 阅片 时应 加 以重 视 ） ；但很 快 机体 可产 生 针对 荚 膜 的抗 性粒 细 胞对 致病 菌 的吞 噬作 用 ，虽然 淋 巴细 胞及 抗 体 等特 异性 免 体 ， 抗 体 与有 荚膜 的细 菌结 合 ， 启 动 补 体 细胞 毒 作 用 ， 最 终 菌 体被 疫 也起 到一 定作 用 ， 但 最终 还要 依靠 白细 胞 的吞噬 消化 。因 而在涂 白细胞 所吞 噬 。镜下 可 见被 中性 粒 细胞 吞 噬 的肺 炎 链球 菌 外 围 的 片的 阅片 时若 能观 察 到被 中性 粒细 胞吞 噬 的 细菌则 可 初步 认 定为 不着 色 区域 极 窄甚 至 消失 ，而未 被吞 噬 的菌 体外 围有一 圈 明显 的 致病 菌 ， 结合 培养 情况 ， 最终 可确 认 为病 原菌 。具体 操作 如下 ： 不 着色 的 区域 。 也 即是 说 ， 若镜 下 观察 到类 似位 于 中性 粒 细胞 内 的 肺炎 链球 菌 外 围有 明显 荚膜 时 多为粘 附现 象 。同时 ， 可通 过显 微镜 １ 涂 片的 制备 用 竹签 挑取 适 量痰 液均 匀涂 成 一分 硬 币大 小 的薄 膜 ，并 进行 微螺 旋 上下 调节 观 察菌 体 的焦距 位 置是 否 与 中性粒 细胞 的胞 核处 革 兰 氏染 色 。 首 先涂 片必须 染好 ， 才能 使 胞浆 和胞 核色 彩对 比度强 于同一 层面 上加 以确 定 。 烈—— 胞 核着 色深 ， 而 胞浆 着 色浅 ， 此 时若 有被 吞 噬 的细 菌则 可 一 ３ 培 养与 涂片 相结 合 ， 找 出真 正致 病菌 ， 指导 临床 用药 目了然 ， 便 于 阅片 。 首 先 在 培养 基 上 找 出可 疑 致病 菌 （ 也有 可 能 为定 植 菌 ） ， 而 有 ２ 阅 片 些痰 标本 可 能 会培 养 出两种 或 两 种 以上 的可 疑 致病 菌 的 菌 落 ， 或 ２ ． １ 选 择 阅 片部 位 ： 阅片 时 应着 重 观 察 白细 胞 较 密集 （ 符合 要 求 的 者培 养 出某些 条件 致 病菌 （ 如 卡他 布 兰汉 氏菌 等 ） 无法 确定 是 否 为 痰标 本应 在 低倍 镜视 野 中 ≤１ ０ 个鳞 状 上皮 细 胞 ， 以及 ≥２ ５ 个 白细 可疑致 病菌 时 ， 则可借 助涂 片加 以确 认 。若能 在涂 片 内找到 被 中性 胞ｆ １ ］ ） ， 且 互相 不重 叠 挤压 ， 旁 边没 有 细菌球 （ 团块状 正 常 菌群 集 落 ） 粒细 胞吞 噬 的菌 体 ，将 涂 片 中被吞 噬 细菌 的镜 下 形态 和 培养 出的 或者 鳞状 上 皮细 胞 的部位 ， 否 则 细菌 的粘 附 现象严 重 ， 易误 认 为 吞 细菌 的菌 落形 态 以及 菌落 涂 片细 菌形 态一 一 对应 起来 ，培 养与 涂 噬现 象 ， 而错 误 地判 断该 菌为 为致病 菌 。 片相 结合 ， 若 三者 同 时指 向 同一种 菌 ， 则可 轻 松确 认 为致 病 菌 。最 ２ ． ２区分 吞噬 与粘 附 ： 若涂 片 中见 到细 菌在 中性粒 细 胞 内被 吞 噬或 后挑 取此 菌进 行分 纯鉴 定 以及药 敏试 验并 发 出报 告 。 者有细菌与白细胞伴行现象可能为致病菌。 份 好 的细 菌鉴 定报 告 ，可 以为 临床 医 生提 供 有价 值 的治 疗 ２ ． ２ ． １ 细菌被中性粒细胞吞噬的镜下特征 ：细菌菌体所有部分均应 信息 ， 使 他们更 快更 准确 地 为患 者合理 用药 ， 使 患者 及早 康复 。 全 部位 于 中性 粒 细胞 的胞 浆 中 ，菌体 着 色相 对 于细 胞外 的细菌 稍 参考 文献 『 １ １ 叶应妩 ， 王毓三 ， 申子瑜 ． 全 国临床检 验操 作规 程 （ 第三版 ） 中华人 宁夏第 五人 民医院石 嘴山 中心医 院检验科 （ ７ ５ ３ ２ ０ ０ ） ２ ｏ １ ４ 年 ８ 月 ２日收稿 民共和 国卫 生部 医政 司【 ｓ １ ． 南京 ： 东南 大学 出版社 ， ２ ０ ０ ６ ： ７ ４ ４ ．