木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计

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木瓜汁中提取木瓜蛋白酶
一、粗酶制备(冻存、调整浓度)
1. 蛋白质浓度(考马斯亮蓝法)
二、纯化和固定化
1. 双水相(PEG/磷酸盐)萃取,再过阳离子纯化;
2. 粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化(咪唑梯度洗,电泳看效果);
3. 先双水相,取PEG相(上清)用亲和磁珠纯化和固定化;
三、纯度
1. 快速蛋白质液相色谱;
2. 非变性碱性蛋白质电泳;
四、酶活性
1. 水解酪蛋白活性(固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重
复使用);
2. 水解IgG检测特异性;
五、载体/相表征
亲和磁珠:TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外;
双水相:

一、新鲜木瓜制备粗酶[1,2]
1. 新鲜的木瓜用去离子水洗干净,再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵
向2-3mm深的切口,让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。-20 ℃存
放。(或者10mL 汁液加90mL pH 6.0的PBS,搅拌15min,4 ℃ 9000×g离心
取上清(除去不溶物),最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。)
2. 将解冻后的乳胶与40 mM半胱氨酸按3:1 (w/v)的比例混合,用6M HCl
将悬浮液调整为pH 5.6,在4 ℃搅拌15 min,过滤并用6 M NaOH将滤液pH调
整为9.0,4 ℃ 9000×g离心取上清(除去不溶物),最后测定上清中的蛋白质含
量,然后用水/PBS调节。可省略。
3.

[1] Nitsawang S, Hatti-Kaul R, Kanasawud P. Purification of papain from Carica
papaya latex: Aqueous two-phase extraction versus two-step salt precipitation[J].
Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.
[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioning
process to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].
Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.