间接免疫荧光操作步骤

细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤

细胞爬片：

1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。将培养基预热至适宜的温度。

2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。

3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。

4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。

5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。

固定：

1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。

2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。

3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。

免疫荧光：

1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。 2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。

3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。

4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。

5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。

6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。

7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。

细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。

细胞免疫荧光步骤

方法一：

1. 首先需要把细胞养在玻璃片上〔悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片〕

2. 然后在 4％ PFA里面室温下固定 30 分钟， PBS洗两次， 0.1%TX-100 室温下作用 1－ 2 分钟使细胞膜通透。

3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器〔面积大，扁平状的，比方大的培养皿〕里面，放一张用水打湿的

滤纸，以保持湿度。

4. 剪一片适宜大小的 parafilm ，在上面滴上稀释在 1％ BSA/TBS中的一抗〔稀释倍数依具体抗体而定〕，每个玻

璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面〔细胞面朝下〕，室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS里洗三次。

5. 接下来二抗孵育步骤同上。

6. 最后，在载玻片加上 mountingmedium 〔大约每个玻璃片加 10ul 〕，把玻璃片放上去〔细胞面朝下〕， 37度 30

分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做 WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次〔可以都试一下看看那种方法适宜〕。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物， 我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体， 二抗那么是不同荧光信号标记的，

我用的是 donkeyanti-rabbit-FITC 〔绿〕和 donkeyanti-rat-Tex-Red 〔红〕。

2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵

育过夜比拟好，背景比拟清晰。

3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片， 阴性对照那么分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是 PBS+荧光标记物。

传播优秀Word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！

1 / 6 方法一：

1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）

2. 然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。

3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4. 剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5. 接下来二抗孵育步骤同上。

6. 最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记 的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey

anti-rat-Tex-Red（红）。

2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过 夜比较好，背景比较清晰。

3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。

免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明

一、试剂和溶液

10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和 2.4g KH2PO4 加 1L 纯水，调 pH 至 7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释 10X PBS；1× PBST：含 0.05% Tween-20 的 1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于 100ml PBS 通透液：0.1%

triton-100 封闭液：PBS 配制的 3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释

二、实验步骤

1. 细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在 12 孔板中，然后接种细胞，置于 37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为 40%-50%（做爬片的细胞一般 是复苏细胞传代 2 代后的细胞）；

2. 洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min；

3. 固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置 20min,倒掉多聚甲醛，加入适量 PBS；

4. 冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至 7）；

5. 解冻：常温下放置 30 min；

6. 洗涤： PBS 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min；

7. 通透：加入适当体积的通透液室温放置 10min。（若蛋白为膜表达则无需此步）

8. 洗涤：PBS 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min；

9. 封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置 30 min；

10. 一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育 60min；

11. 洗涤：PBST 轻微振荡洗涤 3 次,每次 5min；

12. 二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗， 37℃避光孵育 50 min；（如果一抗是荧光素标记的 则无需此步）；