溶菌酶简介
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溶菌酶的分子量
溶菌酶,又称溶菌素或溶菌酶素,是一种产生于多种来源的酶类,能够分解细菌细胞壁中的N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰乙氨酸键,从而导致细菌诱导的溶解。
此类酶可以广泛存在于生物体内,如人体的血液和上皮组织、植物中、动物体内菌群中等等。
溶菌酶能够起到治疗细菌感染等疾病的作用,在医疗保健中具有重要地位。
在溶菌酶的分子中,其分子量与其具有的生理活性、来源以及酶类的种类相关。
一般而言,溶菌酶的分子量较小,在基础的生物酶类中属于中等分子量范畴。
根据多项实验测定结果,目前所知的溶菌酶分子量从几千到九十万不等。
以人体源溶菌酶为例,其分子量大约为30000,而革兰氏阳性菌产生的溶菌素就会具有较大的分子量。
此外,在绝大多数情况下,溶菌酶的分子量是由酶本身的氨基酸组成决定的,一般在30kDa以下,常常是双肽链分子,可分解细菌细胞壁,并在分子水平上发挥生理活性。
总的来说,溶菌酶具有多种生物学活性,随着制备技术以及研究成果的不断增加,其分子量等生理特性也将得到进一步明确和深入研究。
在未来,我们将更好地利用溶菌酶对治疗感染疾病的研究成果,为人类健康事业带来更好的发展和进步。
溶菌酶的名词解释溶菌酶是一种存在于细菌、动物和植物等生物体内的酶类物质,具有分解细菌细胞壁的能力。
这种酶广泛存在于自然界中,对于维持生态平衡和机体免疫防御方面都起着重要作用。
在这篇文章中,我们将详细探讨溶菌酶的特性、功能和应用。
一、溶菌酶的特性溶菌酶是一种水解酶,主要通过水解β-1,4-糖苷键的酶解作用,切断细菌细胞壁的纤维素和肽聚糖链。
溶菌酶可以依据其作用对象分为两类:1)内源性溶菌酶:存在于许多生物体内,如人体分泌的唾液、眼泪、鼻涕中,以及动物和植物体内的细胞和体液中;2)外源性溶菌酶:来自于环境中,如一些细菌和真菌分泌的溶菌酶。
溶菌酶的分子量通常在10,000至20,000道尔顿之间,具有抗菌谱较广的特点。
它是一种相对稳定、热稳定性较好且在酸性条件下活性仍保持较高的酶类物质。
二、溶菌酶的功能溶菌酶在生物体内扮演着重要的角色,具有多种功能。
1)免疫防御:溶菌酶在机体免疫系统中起到重要的作用。
当细菌感染机体时,免疫细胞会释放溶菌酶来破坏细菌的细胞壁,从而抑制其生长和扩散。
这对于维持机体的免疫稳态具有至关重要的意义。
2)消化道健康:人体消化道中存在着多种细菌,其中一些是有益的菌群。
溶菌酶可以促进这些有益菌的生长和繁殖,维护消化道健康。
同时,它还能降低有害菌在消化道内的数量,减少感染和疾病的风险。
3)食品工业应用:由于溶菌酶对细菌具有特异性的杀菌作用,它在食品工业中具有广泛的应用前景。
比如,将溶菌酶应用于食品加工中,可以延长食品的保质期,改善产品的质量和卫生安全性。
三、溶菌酶的应用溶菌酶的研究和应用领域非常广泛,涉及生物医药、食品工业、环境科学等多个领域。
1)生物医药领域:溶菌酶已被广泛应用于临床医学中,特别是在抗生素研发和治疗上。
由于细菌在抗生素中产生耐药性的情况日益严重,溶菌酶作为一种具有独特杀菌作用的物质,被认为是改善抗生素疗效的有力补充。
此外,溶菌酶还可用于细菌感染的快速诊断和疗效评估。
2)食品工业领域:溶菌酶在食品加工过程中的应用正在得到重视。
溶菌酶的作用
溶菌酶是一种具有溶菌活性的酶类,主要作用是溶解细菌细胞壁。
溶菌酶能够针对某些细菌的细胞壁进行特异性作用,使细菌细胞壁发生溶解和裂解,最终导致细菌死亡。
溶菌酶的作用机制主要是通过降解细菌细胞壁的关键组分——肽聚糖(peptidoglycan),即细菌细胞壁的主要构成成分。
溶
菌酶能够切割细菌细胞壁上的肽聚糖链,使其断裂,然后通过肽链的剪切和水解作用,使肽聚糖链上的化学键断裂,导致肽链的解结和肽聚糖的降解。
在溶菌酶的降解作用下,细菌细胞壁失去了支撑作用,细菌内外压力差异失衡,导致细菌细胞壁的断裂和细菌细胞膜的塌陷。
细菌细胞膜的塌陷会导致细菌细胞内外物质的交换失去正常调控,最终导致细菌细胞的溶解和死亡。
溶菌酶作为免疫系统中的一种重要防御分子,在人体免疫反应中发挥着重要的作用。
它可以通过特异性地识别和作用于细菌细胞壁,而不会对周围的人体细胞产生损伤。
同时,溶菌酶也是细菌感染治疗中的重要药物,可以用来治疗一些细菌感染性疾病,如肺炎、葡萄球菌感染等。
总之,溶菌酶通过针对细菌细胞壁的特异性降解作用,对细菌细胞壁进行溶解和裂解,最终导致细菌死亡。
它在免疫系统中发挥着重要的防御作用,并且可以用于治疗某些细菌感染性疾病。
高中生物溶菌酶知识点总结大全溶菌酶是一种在生物体中广泛存在的酶类,它在高中生物课程中占有重要地位,因为其在生物防御机制中的作用以及在科学研究中的应用。
本文将对溶菌酶的结构、功能、分类、生物学意义以及在工业和医学上的应用进行详细的总结。
一、溶菌酶的结构溶菌酶是一种基本不受糖基化影响的酶,其结构主要由氨基酸序列决定。
人类溶菌酶由130个氨基酸残基组成,具有一个明显的β-折叠结构。
这种结构使得溶菌酶能够紧密地结合到细菌细胞壁的多糖上,从而破坏细胞壁的结构完整性。
二、溶菌酶的功能溶菌酶的主要功能是作为生物体的防御机制,对抗外来细菌的侵袭。
它通过水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4-糖苷键,导致细胞壁破裂,细菌最终溶解死亡。
这种抗菌作用对于人体的免疫系统尤为重要,尤其是在皮肤和黏膜表面,溶菌酶能够帮助抵御病原体的入侵。
三、溶菌酶的分类根据溶菌酶的来源和特性,可以将溶菌酶分为几类:1. 鸡蛋溶菌酶:从鸡蛋清中提取,是最常用的溶菌酶之一。
2. 人类溶菌酶:存在于人的唾液、泪液和其他体液中,对维护人体健康起到重要作用。
3. 植物溶菌酶:在某些植物中也发现有溶菌酶的存在,如菠萝和木瓜。
4. 微生物溶菌酶:由某些微生物产生,用于对抗其他微生物。
四、生物学意义溶菌酶在生物体中具有重要的生物学意义。
首先,它是天然免疫系统的一部分,帮助生物体抵御细菌感染。
其次,溶菌酶还能够调节炎症反应,因为它能够影响免疫细胞的活性。
此外,溶菌酶的存在也能够帮助生物体清除死亡的细胞和细胞碎片,维持组织的健康状态。
五、工业和医学应用溶菌酶在工业和医学领域有着广泛的应用。
在工业上,溶菌酶可用于食品保鲜,防止食品变质和延长保质期。
在医学上,溶菌酶可用于治疗某些细菌感染,尤其是在对抗生素有耐药性的细菌面前,溶菌酶提供了另一种治疗选择。
此外,溶菌酶也被用于化妆品和清洁产品中,利用其抗菌特性来保持产品的卫生和安全性。
六、溶菌酶的提取和纯化溶菌酶的提取通常采用物理和化学方法相结合的方式。
溶菌酶的种类及其应用溶菌酶是一类能够降解细菌细胞壁的酶,它主要作用于细菌细胞壁上的胆甙酸和穿梭肽链,从而导致细菌细胞壁的破裂和细菌的死亡。
溶菌酶存在于许多生物中,包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫和微生物等。
溶菌酶被广泛应用于医药、食品、农业和环境等领域。
1. 甲氧西林酶 (lysostaphin)甲氧西林酶是一种由金黄色葡萄球菌产生的溶菌酶,主要作用于革兰阳性细菌的细胞壁。
甲氧西林酶具有很高的特异性,可以高效地杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,对于治疗金黄色葡萄球菌相关感染具有重要意义。
2. 心脏溶菌酶 (lysozyme)心脏溶菌酶是一种常见的溶菌酶,存在于多种生物中,包括人类、鸡、蛋白和昆虫等。
心脏溶菌酶主要对细菌细胞壁的N-乙酰葡萄糖胺聚糖链起到溶解作用。
它具有广谱的抗菌活性,对于控制和预防细菌感染具有重要意义。
3. 乳酸菌溶菌酶 (lactic acid bacteria bacteriocin)乳酸菌溶菌酶是一类由乳酸菌产生的溶菌酶,主要作用于肠道中的细菌。
乳酸菌溶菌酶对于调节肠道菌群平衡、维持肠道健康具有重要作用。
此外,乳酸菌溶菌酶还具有抗菌活性,可以用于食品工业中的食品防腐和保鲜。
4. 枯草杆菌普查酶 (Bacillus gastrointestinal enzyme)枯草杆菌普查酶是一种由枯草杆菌产生的溶菌酶,具有广谱的抗菌活性。
枯草杆菌普查酶对于治疗和预防呼吸道和消化系统感染具有重要意义。
此外,枯草杆菌普查酶还可应用于食品工业中,用于防治食品中的致病菌。
溶菌酶的应用:1.医药领域:溶菌酶可以用于制备抗菌药物,例如利用溶菌酶破坏细菌细胞壁,从而导致细菌死亡。
此外,溶菌酶还有助于治疗耐药菌感染,如利用甲氧西林酶治疗金黄色葡萄球菌感染。
2.食品工业:溶菌酶可以用于食品防腐和保鲜。
例如,乳酸菌溶菌酶可以用于发酵食品的防腐,从而延长其保质期。
此外,溶菌酶还可以用于优化食品的风味和口感,提高食品的品质。
1922年,英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌用,故命名为溶菌酶。
溶菌酶广泛地分布于自然界中,在人的组织及分泌物中可以找到,动物组织中也有,以鸡蛋清中含量最多。
其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。
它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶,分泌到细胞外杀死细菌的。
它存在于卵清、唾液等生物分泌液中,催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1,4-β-糖苷键水解的酶。
它可以溶解掉细菌的细胞壁,杀死细菌。
由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁,并且自身没有毒害,因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂,在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。
随着开发和应用研究的进一步深入,溶菌酶的发展前景将会十分广阔。
下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。
在食品工业中,溶菌酶是无毒的蛋白质,能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性,而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。
因此,它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等),以达到延长食品货架期的目的,是一种很好的天然防腐剂。
现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。
1 溶菌酶的分类溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。
1.1 细菌溶菌酶细菌溶菌酶通常可分为三大类:N-乙酰氨基己糖苷酶,它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键;N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶,它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基;内肽酶,它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。
1.2 真菌溶菌酶真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。
1.2.1 几丁质酶虽然一些外几丁质酶(exochitinases;EC3.2.1.30)也表现出抗真菌的特性,但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases;EC3.2.1.14)。
溶菌酶释放蛋白
溶菌酶是一类能够溶解细菌细胞壁的酶,主要存在于动植物的体液中,也包括人体内。
当溶菌酶作用于细菌时,它能够破坏细菌的细胞壁,导致细菌溶解。
在这个过程中,蛋白质等细胞内成分会被释放。
具体而言,溶菌酶释放蛋白的过程如下:
1. 细菌感知和结合:溶菌酶会与目标细菌发生特异性结合。
这一过程通常是通过溶菌酶与细菌表面的特定分子相互作用实现的。
2. 细菌细胞壁降解:溶菌酶作用于细菌细胞壁,主要是通过水解作用,导致细胞壁的降解。
溶菌酶特异性地作用于细菌细胞壁的主要成分,如肽聚糖和糖脂。
3. 蛋白质释放:细菌细胞壁被破坏后,其中的细胞质内含物,包括蛋白质、核酸、酶等,会被释放到周围环境。
4. 对细菌的溶解:由于细胞壁的破坏,细菌的形态会发生变化,最终导致细菌的溶解。
这有助于防止细菌感染在宿主体内的扩散。
总的来说,溶菌酶通过破坏细菌细胞壁,导致细菌的溶解,使细菌内部的蛋白质等成分释放到周围环境。
这是一种天然的防御机制,帮助宿主对抗细菌感染。
在医学和食品工业中,溶菌酶的应用也得到了一定的研究和开发。
溶菌酶的种类及其作用溶菌酶是一类具有溶解细菌细胞壁作用的酶,广泛存在于动物、植物和微生物体内。
它能够通过降解细菌细胞壁的主要成分——胆碱酸聚合物,从而使细菌失去保护屏障,进而导致细菌死亡。
溶菌酶在医学、食品工业和生物技术等领域具有重要的应用价值。
根据其来源和作用机制的不同,溶菌酶可以分为多个种类。
以下是常见的几种溶菌酶及其作用:1. 乳酸菌溶菌酶:乳酸菌溶菌酶是一类来源于乳酸菌的溶菌酶,主要作用于革兰氏阳性菌。
乳酸菌溶菌酶能够降解细菌细胞壁的胆碱酸聚合物,破坏细菌细胞壁的完整性,从而导致细菌死亡。
乳酸菌溶菌酶广泛应用于食品工业中的发酵过程和食品保鲜中,具有抑制细菌生长、改善食品质量的作用。
2. 枯草杆菌溶菌酶:枯草杆菌溶菌酶是一类来源于枯草杆菌的溶菌酶,主要作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
枯草杆菌溶菌酶具有较强的抗菌活性,能够迅速破坏细菌细胞壁,引起细胞内容物泄漏,最终导致细菌死亡。
枯草杆菌溶菌酶在医学领域被广泛应用于抗感染药物的研发和生产中。
3. 葡萄球菌溶菌酶:葡萄球菌溶菌酶是一类来源于葡萄球菌的溶菌酶,主要作用于革兰氏阳性菌。
葡萄球菌溶菌酶能够降解细菌细胞壁的胆碱酸聚合物,破坏细菌细胞壁的完整性,从而导致细菌死亡。
葡萄球菌溶菌酶在医学领域被广泛应用于抗感染药物的研发和生产中。
4. 嗜肺军团菌溶菌酶:嗜肺军团菌溶菌酶是一类来源于嗜肺军团菌的溶菌酶,主要作用于革兰氏阴性杆状菌。
嗜肺军团菌溶菌酶能够降解细菌细胞壁的胆碱酸聚合物,破坏细菌细胞壁的完整性,从而导致细菌死亡。
嗜肺军团菌溶菌酶在医学领域被广泛应用于抗感染药物的研发和生产中。
除了上述几种常见的溶菌酶外,还有其他一些来源于不同微生物的溶菌酶,如链球菌溶菌酶、肺炎克雷伯杆菌溶菌酶等。
这些溶菌酶在不同领域具有不同的应用价值。
总之,溶菌酶是一类具有溶解细菌细胞壁作用的重要酶类,在医学、食品工业和生物技术等领域具有广泛应用价值。
通过降解细菌细胞壁的胆碱酸聚合物,溶菌酶能够破坏细菌细胞壁的完整性,引起细胞内容物泄漏,最终导致细菌死亡。
溶菌酶(lysozyme)是一种存在于生物体内的酶类蛋白质,具有降解和杀灭细菌细胞壁的作用。
它通过水解细菌细胞壁的β-1,4-苷键,使其发生断裂,导致细菌细胞失去结构完整性而死亡。
β-1,4-苷键是细菌细胞壁中的一种化学键。
细菌细胞壁主要由多糖聚合物组成,其中包括聚N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,NAG)和聚N-乙酰穆尔酰葡萄糖胺(N-acetylmuramic acid,NAM)交替排列形成的链。
这些链通过β-1,4-苷键连接在一起,形成网状结构的细菌细胞壁。
溶菌酶通过与细菌细胞壁中的NAG和NAM之间的连接处结合,并水解连接它们的β-1,4-苷键。
这导致细菌细胞壁的结构破裂,细胞壁无法维持完整性,进而导致细菌细胞的溶解和死亡。
溶菌酶的作用在免疫系统中具有重要意义,它是人体自然免疫的一部分,可以帮助防止细菌感染。
溶菌酶广泛存在于多种生物体内,包括唾液、眼泪、汗液等体液中,具有抗菌和抗病毒的作用。
溶菌酶的结构与功能
溶菌酶又称裂菌酶,是一种酶类蛋白质,其主要功能是分解细菌细胞壁,从而造成细菌的死亡。
结构:
溶菌酶的分子量一般在10kDa左右,其分子结构一般由单个多肽链构成,由约100个氨基酸组成,形成一个不规则的α螺旋结构。
在这个不规则的α螺旋结构中,溶菌酶的N-端和C-端形成了两个球形蛋白结构,而中间部分则由α螺旋构成。
功能:
溶菌酶主要是通过对细菌细胞壁的水解作用来实现抑制感染的作用。
细菌细胞壁一般包括两层,内层是由多糖组成的,外层则是由蛋白质和糖组成的。
当溶菌酶进入细菌细胞中时,它会首先与内层的多糖产生结合作用,然后开始分解多糖分子,最终导致细菌细胞的死亡。
此外,在医学上,溶菌酶也被用于溶解血栓、治疗炎症和肿瘤等多种疾病。
溶菌酶综述耿红健基础药学基地班09104103溶菌酶分离提纯、纯度鉴定以及活力测定综述耿红健基础药学基地班 0910103溶菌酶简介溶菌酶名称起源于1922 年,Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,就命名为溶菌酶。
此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶马等动物乳汁中,也可以从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中可分离菌酶的存在。
溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中,可以从牛、羊、出溶菌酶,其中蛋清溶菌酶含量最丰富,约为0.3%~0.4% 。
溶菌酶是一种碱性球蛋白,其分子由129个氨基酸组成,2200个原子,分子量14388-18000(14388、14500、18000),等电点为10.7-11.0,分子内有4个二硫键交联,化学性质非常稳定,对热也极为稳定,Sbaharu等报告牛奶中的溶菌酶分子量为18000,一级结构尚未清楚。
人乳中的溶菌酶和a-La的一级结构有74%是相同的。
Ⅱ一La是人乳中含量较多的蛋白质。
它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的.是乳糖合成酶的辅酶。
溶菌酶和d-La在生物学上是同源的,但它们的三级结构有很大的区别。
它可溶解许多细菌的细胞膜.使细胞膜的糖蛋白类多糖发生加水分解作用。
分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸较高,如色氨酸的比例较高。
酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸,溶菌酶通过其肤键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成徽生物细胞壁的N_一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁质酸间的B一(1,4)糖苷键,使菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的。
此外,溶菌酶的最适温度为50度,最适Ph为6,溶菌酶具有热稳定性,100摄氏度保持十分钟仍具有活性。
溶菌酶是动物自身的重要免疫因子,是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶。
具有杀菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进有益菌繁殖等作用,并具有对人禽无毒、无药害残留、无副作用等优点。
目前已经被众多领域广泛应用。
水解细菌细胞壁,在细菌形态学观察中表现出很强的溶菌现象。
并可以阻止流感病毒和腺病毒等病毒的繁殖致病,与带负电荷的病毒蛋白直接作用,和DHA、RNA的脱辅基蛋白直接形成复合盐,使病毒失活。
溶解酶还作为机体非特异性免疫因子之一,参与机体多种免疫反应,能提高机体强大抵抗力。
此外,还具有激活血小板机能,改善局部组织血液循环,促进机体损伤组织修复等功能。
主要特点1、具有消炎、溶菌(杀菌),促进机体组织修复和增强机体免疫力等供销,防治效果显著。
从对临床防治来看,平均预防有效率为95%以上。
治疗有效率达85%以上。
综合性能显著优于目前临床上所使用的常用抗生素药物。
2、抗菌谱广。
对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌等致病菌有抑杀作用。
对耐药菌株效果尤佳,不会产生耐药性。
3、具有抗病毒作用:对流感,呼吸道疾病及水生动物中的病毒性疾病有显著的防治效果。
4、与抗生素类药物合并使用时具有增效功能,可适当减少抗生素用量。
5、长期使用能改善肠道的微生态环境。
杀灭有害菌,促进有益菌繁殖,显著提高采食粮;增强消化吸收功能;能明显提高生长速度和饲料利用率,获得很好的经济效益。
溶菌酶本身是属于耐高温的酶,具有高度稳定性,能承受饲料制粒工艺的高温处理几长期储存。
特点功能:1.用于畜禽及水生动物,由球菌、杆菌等细菌引起的黄白痢、肠胃炎等疾病治疗和预防,效果显著。
2.抗病毒,对流感、高热和呼吸道疾病及水生动物中的病毒性疾病都有显著的防治效果。
3.与抗生素类药物合并用药时具有增效功能,可适当减少抗生素的用量,以防止产生耐药菌。
国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,编号E C3.2.1.17,与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。
根据其来源不同一般可将溶菌酶分6 类:C型(chicken)、G型(goose)、无脊椎动物型(invertebrate-type)、噬菌体、细菌和植物来源溶菌酶。
不同来源酶的分子量、氨基酸组成及酶特性各有不同,但三维结构显示来源于共同的进化起源。
目前对C型溶菌酶研究较多,它是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链,含有4对二硫键,三维结构为较紧密的椭球形,它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类和无脊椎动物如昆虫、甲壳类中。
溶菌酶基本理化性质及作用机理:①溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白,化学性质非常稳定。
当pH值为1.2~11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。
在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强;当pH值为4~7,100℃处理1 min 仍能保持原酶活性;当pH值为3时能耐100℃加热处理45min;在干燥条件下,溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。
黄色的结晶体或无定形粉末,无臭,味甜。
易溶于水,遭碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚[5]。
【实验材料】1.实验器材循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机;冰箱;透析袋;酸度计;部分收集器;恒流泵;圆盘电泳装置;恒温水浴锅;层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm);布氏漏斗(500mL);吸滤瓶(1000mL);G-3砂芯漏斗(500mL)2.实验试剂⑴鸡蛋清(鲜鸡蛋)⑵底物微球菌粉⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂⑷固体氯化钠(NaCl);固体硫酸铵(NH4)2SO4;固体磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O);固体磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O);固体磷酸钠(Na3PO4)⑸乙醇;蒸馏水;甲醇;考马斯亮蓝;三氯醋酸;丙酮(6) 溶菌酶标准品;Sephadex G50⑺ N-乙酰葡萄糖胺;硫酸铜;硫酸亚铁;硫酸锌;氯化镁;氯化钙;氢氧化钠;盐酸⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂(见实验六);蛋白含量测定(福林法)试剂(见实验二)⑼聚乙二醇-20000、两性电解质【实验操作】1.蛋清的制备将4~5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞,使蛋清流出(鸡蛋清pH值不得小于8),轻轻搅拌5分钟,使鸡蛋清的稠度均匀,用两层纱布过滤除去脐带块,量体积约为100ml.2.鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水,均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右,用脱脂棉过滤收滤液。
3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析⑴ D152树脂处理:将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物,滤出,用1mol/L NaOH 搅拌浸泡并搅拌4~8小时,抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂,直到全部转变成氢型,抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5,保持过夜,如果pH之不低于5.0,抽滤干HCl,用2mol/LNaOH 处理树脂使之转变为钠型,pH值不小于 6.5。
吸干溶液,加pH6.5 0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
⑵装柱:取直径1.6cm,长度为30cm的层析柱,自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液,关闭层柱出口,待树脂沉降后,放出过量的溶液,再加入一些树脂,至树脂沉积至15~20cm高度即可。
于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂,使流出液pH为6.5为止,关闭柱子出口,保持液面高出树脂表面1cm左右。
⑶上柱吸附:将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部,打开出口使其缓慢流入柱内,流速为1ml/min。
⑷洗脱:用柱平衡液洗脱杂蛋白,在收集洗脱液的过程中,逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况,当基线开始走平后,改用含 1.0mol/L NaCl 的pH值6.5,浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱,收集洗脱液。
⑸聚乙二醇浓缩:将上述洗脱液合并装入透析袋内,置容器中,外面覆以聚乙二醇,容器加盖,酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。
当浓缩到5mL左右时,用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇,小心取出浓缩液。
(6) 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。
4.Sephadex G50分子筛柱层析⑴装柱:先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇,用6g/LNaCl 溶液搅拌Sephadex G50数分钟,再抽滤,反复多次直至无醇味为此。
(如果Sephadex G50是新的,则按实验五中的方法处理凝胶)。
加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液,充分搅拌,超声除去气泡,装入玻璃层析柱(1.6×50cm),柱床45cm。
⑵上样:与实验五中的方法相同。
⑶洗脱:样品流完后,先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品,连接恒流泵,使流速为0.5mL/min,用部分收集器收集,每10分钟一管。
⑷聚乙二醇浓缩:合并活性峰溶液,用聚乙二醇浓缩到5mL左右时,用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇,小心取出浓缩液。
⑸透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。
收集透析液,量取体积。
5. 溶菌酶活力测定⑴酶液配制:准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液,再将酶液稀释成50µg/ml.⑵底物配制:取干菌粉5mg加上述缓冲液少许,在乳钵中(或匀浆器中)研磨2分钟,倾出,稀释到15~25ml,此时在光电比色上的吸光度最好在0.5~0.7范围内。
5.3 活力测定:先将酶和底物分别放入25O C恒温水浴预热10分钟,吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中,在450nm波长读出吸光度,此为零时读数。
然后吸取样品液0.2mL(相当于10µg酶),每隔30s读1次吸光度,到90s时共计下四个读数。
活力单位的定义是:在25℃,pH6.2,波长为450nm时,每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。
酶的活力单位数=△Anm/t×0.001450比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质6.选做实验(1)溶菌酶的热稳定性:取G50峰2的溶菌酶2ml放入恒温水浴槽中,逐步升温,每隔五度测其酶活力。
(2)溶菌酶的最适Ph值:于小试管中加入1mlG50峰2的溶菌酶,并加入等量缓冲液,Ph分别为4、5、6、7、8,同时将底物pH值调整为4、5、6、7、8,底物与酶的pH值一一对应,在50度的条件下测其酶活力。
(3)米氏常数的测定:配置不同浓度的底物,与等量的酶反应(4)等电点的测定等等附:○1蛋白质含量测定方法比较一、Folin-酚试剂法(Lowry法)原理:蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基,能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。
反应过程分为两步,第一步:在碱性溶液中,蛋白质中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物;第二部:蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸,生成蓝色化合物。