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海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究

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海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究李　群　袁勤生　李永丰(华东理工大学生化研究所,上海200237) 摘　要　初步研究了海藻糖在保护酶蛋白热稳定性方面的作用。

实验表明:海藻糖可以作为一种天然保藏剂,有效地提高酶蛋白的热稳定性;本文还分别比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖对酶蛋白的保护效果,结果发现海藻糖保护效果最佳,蔗糖次之,葡萄糖和甘露醇较差。

关键词　海藻糖;乙醇脱氢酶;超氧化物岐化酶(SOD);热稳定性 酶在医药、化工、食品及临床与化学分析等领域获得了广泛的应用。

但是由于酶不稳定而使其应用开发受到限制。

虽然引起酶蛋白变性的因素很多,如物理因素、化学因素以及生物学因素等,但是温度却是造成酶失活的最主要因素。

近年来,一种建立在海藻糖基础上的天然保藏剂,为酶的热稳定性保护提供了新的方法。

海藻糖是由两个葡萄糖残基通过半缩醛羟基结合而成的一个非还原性二糖,在昆虫、无脊椎动物、酵母、真菌的孢子和子实体以及高等植物中都发现其存在,化学性质很稳定[1]。

本文采用海藻糖作为酶的稳定介质,初步研究了它对乙醇脱氢酶和SOD 的保护作用,并比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖在保护酶活方面的效果。

1　材料与方法1.1　材料海藻糖由上海生化试剂商店提供;SOD 由华东理工大学生化研究所提供;葡萄糖、蔗糖、甘露醇均为分析纯试剂。

1.2　方法1.2.1　酵母中乙醇脱氢酶的制备[2]150ml0.066mol/L的Na2HPO4溶液加入到达50克酿酒酵母细胞中,37℃水浴中搅拌保温2h后,取出,室温下再搅拌抽提3h,离心弃菌体,上清液立即置于55℃水浴中15m in,冷却后离心,上清液置0℃冰箱中过夜。

冰浴下按每100ml的抽提液中,加入50m l的冷丙酮,20min后,0℃离心,弃沉淀;再在上清液中按每100ml加入55ml冷丙酮, 0℃维持20m in后离心,弃上清液,沉淀用冰水溶解,置透析袋中透析3h,3500r/min下离心20m in,弃沉淀。

每100ml上清液中加入36g硫酸铵,0℃冰箱放置3h,14000r/m in离心20min,弃上清液;沉淀用15ml水溶解,加入3g硫酸铵,盐析3h后离心弃沉淀。

上清液中即含有乙醇脱氢酶。

乙醇脱氢酶活力测定采用Dotzayer 法[3]。

1.2.2　酵母蛋白的制备及测定(4)　20克酵母中加水30ml,在-20℃下速冻2h,取出放在20℃恒温水浴中保温30min,为一次冻融;重复三次。

离心取出上清液,得到酵母蛋白。

利用紫外分光光度计分别测定酵母蛋白溶液样品在260nm,280nm处的吸光度值,按下表计算蛋白含量:蛋白质浓度(mg/m l)= 1.55A280-0.77A26028药　物　生　物　技　术Pharm aceutical Biotechnology　1997,4(1):28～31收稿日期　1996-05-201.2.3　海藻糖对酶热稳定性的影响　分别在25mmol/L、100mmol/L海藻糖溶液中,加入等体积的乙醇脱氢酶溶液,在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的水浴中加热8m in,冰水冷却后,以相应不加热的酶活力作对照(100%),测定乙醇脱氢酶活力保留率。

在加入蛋白质溶液的乙醇脱氢酶溶液中,分别等体积地加入0.5mol/L的海藻糖溶液,不同温度下,水浴8min,冰水冷却后,以相应不加热的酶活力作对照(100%),测定酶活力保留率。

在50m mol/L、100mm ol/L海藻糖的水溶液中分别加入等体积的SOD(1560U),在不同的温度下加热20m in后,冰水冷却,测SOD活力,以不加热的SOD活力作对照(100%),计算SOD活力保留率,SOD活性测定采用改进的邻苯三酚自氧化法[5]。

1.2.4　其它多羟基化合物对酶热稳定性的影响　0.5mol/L葡萄糖、蔗糖、甘露醇分别等体积地加入到乙醇脱氢酶中,不同温度下处理8min,以相应不加热酶活力作对照(100%),测定酶活力保留率。

1.2.5　海藻糖对SOD反复冻融时的活力影响　在50m mol/L、100mm ol/L、500mm ol/L 海藻糖溶液中,分别等体积加入SOD (1835U),0℃冰箱中冷冻,25℃水浴中融化,为一次冻融;重复两次,测SOD活力;以不冻融SOD活力作为对照(100%),测定三次反复冻融后的SOD活力保留率。

2　结果2.1　海藻糖对乙醇脱氢酶活力的保护作用酶活力保留率的高低与海藻糖的浓度密切相关。

从图中可见,500mm ol/L海藻糖的效果最好,25m mol/L海藻糖较差,但是它们都比不加海藻糖的酶溶液活力要高,说明海藻糖可以稳定乙醇脱氢酶。

见图1。

2.2　蛋白质对乙醇脱氢酶稳定性的影响酵母体内的代谢是一个很复杂的过程,体内蛋白质之间的相互作用非常复杂,为了了解体内海藻糖的作用,利用酵母抽提液,检测乙醇脱氢酶活力保留率。

酵母蛋白质的浓度为9mg/ml。

结果见表1。

F ig1.　T hermal stability of alcohol dehy dr ogenase as influenced by trehalose.—◆—500mmol/L　—■—100mmol/L　—△—50mmol/L —×—25mmol/L　—*—ControlT ab1.Pr otecive effects of alcohol dehy dr ogenase by the additio n o f yeast protein and t rehaloseT emper atur e(℃)0.5mmo l/Ltr ehalose+pr oteinP rotein3098.298.44090.686.244.585.577.35071.462.45552.735.757.523.911.26011.5 3.562002.3　海藻糖对SOD热稳定性影响SOD在不同浓度海藻中以不同温度处理20m in,其残余酶活力如表2。

从结果中可看出,相对于空白SOD而言,海藻糖具有保护SOD酶活力的作用,但是由于SOD本身是一个含金属的酶,与其它一些酶相比,对温度不太敏感,因此海藻糖对SOD的热稳定性保护效果不那么明显。

29李群:海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究T ab 2.Pr otective effects of SOD by tr ehalose (%)T emper atur e (℃)100mmol /Lt rehalose 50mmol /Ltrehalose Cont rol6099.599.299.17097.896.595.27595.493.190.78077.774.367.98520.318.516.4907.95.4 3.62.4　其它多元醇化合物对酶活力的保护作用测定了0.5mol /L 葡萄糖、蔗糖和甘露醇对乙醇脱氢酶的保护作用效果,结果见图3。

从实验结果看,蔗糖的保护效果最好,而甘露醇较差。

Fig 2.T her mal stability of alcohol dehydrog enase as influenced by sur co se,g lucose and mannitol.—◆—0.5mol/L surcose —■—0.5mol/L mannitol —△—0.5mol/L glucose —×—Control2.5　海藻糖对反复冻融SOD 稳定性影响酶的反复冻融可使酶活力下降。

但在加入海藻糖后,情况却有所不同。

结果见图4。

一次冻融后,500mol /L 和100mol /L 海藻糖所保护的SOD 活力几乎没有丧失;在经过三次反复冻融后,500mol/L 海藻糖还能使50%的酶活力保存,而同样情况下,不加海藻糖的SOD 活力仅剩36%。

说明在反复冻融时,海藻糖的加入可以起稳定作用。

F ig 3.Stability of SO D as influenced by freeze-thaw -ing.—◆—500mmol/L —■—100mmol/L —△—50mmol/L —×—Control3　讨　论3.1　酶的稳定性一直是困扰其大规模应用的原因为了保持液体酶的活力,国内外大多采用在浓缩酶液中加入金属离子、多元醇、多糖类化合物等方法[6]。

海藻糖作为一种多元醇化合物,既可通过氢键与酶蛋白表面分子相联结,也能通过氢键有效地与外部水分子相联结,使酶蛋白分子稳定。

3.2　酵母蛋白提取液的加入能提高酶的热稳定性这是因为从蛋白质表面相互作用的区域中排除水,因而降低了自由能,增加了蛋白质的热稳定性[7]。

3.3　不同糖类化合物在稳定酶活方面作用各不相同一般认为,二糖比其它糖类的保护效果更加有效;虽然在二糖之间其效果也有不同[8],可以认为热处理时酶活力的保留不仅依靠加入的糖的类型,而且其亚基的定位作用也很重要[9],但是对糖类化合物的具体保护机理还不清楚。

对于海藻糖稳定生物分子30 药物生物技术 4卷的机理目前主要有两种假说:一种称为“水替代”假说(w ater replacement hypothesis )[10],它认为海藻糖与其它多元醇化合物一样,可以同生物分子形成氢键,替代维持空间结构所必需的水分子。

另一种称为“玻璃态”假说(the glassy statetheory)[11],它认为通过海藻糖玻璃化转变的趋势,导致无定型连续相的形成,在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱。

目前,这两种假说还不能完全解释已发现的现象,有待于更进一步的研究。

参考方献1　吴东儒.糖类生物化学.高等教育出版社,1987∶264.2　Racker,E,Cr ystalline alcohol dehy dr ogenase fr om bakers yeast.J.Bio l.chemistry ,1950,184∶313.3　B .施特尔马赫.酶的测定方法.中国轻工业出版社,1992∶144　张炳然,解芳.新编生物化学实验.华东理工大学,1989∶515　谢卫华,袁勤生,姚菊芳.连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的改进.中国医药工业杂志,1988,19(5),217.6　卓肇文.使酶蛋白增加稳定性的途径.生物科学动态,1988(4),22.7　M ozhaev V V ,M art ined kar rel.Str ucture -sta-bility r elationships in pr oteins:new approaches to stabilizing ,Enzy me .M icrob .T echnol .;1984,6(2),50.8　Crow e L M ,Crow e JH and Chapman D.Interac-tionofcarbohydratesw ithdr ydipalm i-to ylphosphatidy lchdine(DP PC ),A rch .Biochem.Biophys.;1985,236∶288.9　Crow e JH,Crow e L M ,Car penter JF Stabilization o n dr y phospho lipid bilayers and prot eins by sug -ar s ,Biochem .J .;1987,242∶1.10Otting G.,L iepinsh E.and W uthr ich K.P rotein hy dr ation in apueo ns solution.Science,1991,254∶974.11Fr anks F ,Hatley ,R HM and M athias SF .M ate-r ials science and the production of shelf-stable bio-logicals.Biopharm.,1991,4∶38.Study on Stabilization of Enzymes by TrehaloseLi qun ,Yuan qinsheng ,Li yongfeng(East China university of science and technology shanghai 200237)We studied the trehalose ′s protective effects on the thermal stability of enzy mes.T he results show ed that trehalose can serve as a naturl protection to increase the thermal stability of parative the protection efficiency of the four carbonhydrates also found that trehalose is the most efficient than three other compounds.Key Words T rehalose,Alcohol dehydrogenase,SOD,Thermal stability31李群:海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究。

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5%海藻糖和1%bsa重组蛋白

5%海藻糖和1%bsa重组蛋白

5海藻糖和1bsa重组蛋白1. 介绍5海藻糖和1bsa (牛血清白蛋白) 重组蛋白是一种常用的生化试剂。

在生物科学领域，它们被广泛应用于蛋白质的稳定保存和实验过程中的稀释和溶解等操作。

5海藻糖和1bsa重组蛋白的制备方法和使用技巧愈发受到研究人员的重视。

2. 海藻糖海藻糖是一种由半乳糖和葡萄糖组成的双糖，具有较强的保水性能，因此常被用作蛋白质的稳定剂。

海藻糖对蛋白质有温和的保护作用，有助于防止蛋白质在制备、保存和实验过程中的变性和聚集。

3. BSABSA是一种丰富的蛋白质，来源于牛血清，具有丰富的营养价值。

在实验室中，BSA也被用作蛋白质的稳定剂，能够提供一定的蛋白质包埋。

BSA还可以降低一些非特异性吸附的发生，从而保持细胞和细胞培养物的稳定性。

4. 制备方法将5海藻糖和1bsa混合溶解于适量的缓冲液中，一般常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液等。

混合物制备后，应充分搅拌使其充分溶解，并根据需要进行无菌滤过以去除微生物。

最终得到的混合物即为5海藻糖和1bsa重组蛋白。

5. 使用技巧5海藻糖和1bsa重组蛋白可以用于多种生化实验中，如酶动力学实验、蛋白质稳定性测试、蛋白质溶解和稀释等。

在使用时，应根据实验要求进行适当的稀释，一般常用的稀释倍数为1:100或1:1000。

在实验中，可根据需要调整海藻糖和bsa的配比以达到最佳的效果。

总结5海藻糖和1bsa重组蛋白作为一种常用的生化试剂，能够有效保护蛋白质并提高实验的稳定性。

制备方法简单，使用技巧灵活，因此在生物科学领域得到了广泛的应用。

但需要注意的是，使用时应严格按照指定的浓度和技术要求操作，以确保实验的准确性和可重复性。

希望在未来的研究中，5海藻糖和1bsa重组蛋白能为更多生化实验带来便利与效益。

5海藻糖和1bsa重组蛋白在生物科学领域的广泛应用5海藻糖和1bsa重组蛋白作为生化试剂，在生物科学研究中扮演着重要的角色。

它们不仅能够保护蛋白质的稳定性，还能够在实验操作中起到辅助作用，确保实验的准确性和可重复性。

海藻糖制备方法及应用研究概述

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海藻糖制备方法及应用研究概述作者：周培华刘兰刘赛侯文慧周颖袁列江来源：《食品安全导刊》2023年第12期摘要：海藻糖为一种性质稳定且不具有还原性的功能糖，具有保护生物活性物质的特殊功能，在各行各业中应用广泛，且具有广阔的发展前景。

本文主要综述了目前海藻糖的制备方法和海藻糖的应用研究，探讨了海藻糖的发展动态及应用前景，以供相关人员参考。

關键词：海藻糖；功能糖；制备方法；应用研究Review on Preparation and Application of TrehaloseZHOU Peihua， LIU Lan， LIU Sai*， HOU Wenhui， ZHOU Ying， YUAN Liejiang（Hunan Provincial Institute of Product and Goods Quality Inspection， Changsha 410017，China）Abstract： Trehalose is a stable and non reducing functional sugar with special functions of protecting bioactive substances. It is widely used in various industries and has broad development prospects. In this paper， the preparation methods of trehalose and the application of trehalose were reviewed， and the development trend and application prospect of trehalose were discussed， for reference by relevant personnel.Keywords： trehalose; functional sugar; preparation method; application research海藻糖是由两个葡萄糖分子以α-1，1糖苷键构成的非还原性糖，性质很稳定，属于一种功能性糖，它具有保护生物活性物质的特殊功能，能很好地保护细胞和营养物质的结构，使生物体在极端异常情况下，仍能保持生命活力[1]。

多羟基化合物对纤维素酶热稳定性影响的研究

多羟基化合物对纤维素酶热稳定性影响的研究

多羟基化合物对纤维素酶热稳定性影响的研究贾晓龙，王越，曹方，崔战友，安家彦【摘要】为提高纤维素酶的热稳定性，研究了几种多羟基化合物对纤维素酶热稳定性的影响，利用酶热失活动力学和热力学及荧光光谱考察了其作用机理。

研究表明，纤维素酶经60～90℃热处理，热失活速率常数逐渐增大，半衰期从119.51 min减少到35.55 min。

纤维素酶热失活显著。

添加多羟基化合物可以提高纤维素酶的热稳定性，保护效果依次为山梨醇＞甘露醇＞甘油＞海藻糖。

纤维素酶的活化能ΔU*、活化焓ΔH*和活化自由能ΔG*均有增加，活化熵ΔS*变化不明显。

表明添加山梨醇和甘露醇的酶的氢键数目增多，有利于酶构象的稳定。

荧光光谱结果显示，多羟基化合物对酶的结构具有稳定作用。

【期刊名称】可再生能源【年(卷),期】2014(032)010【总页数】5【关键词】多羟基；纤维素酶；热稳定性；热失活动力学；荧光光谱0 引言纤维素酶是能够分解纤维素，生成葡萄糖的一类酶的总称，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。

在饲料、纺织、食品等领域广泛使用[1]。

纤维素酶在实际应用中，高温、冷冻、干燥等条件会影响纤维素酶结构的稳定性，进而影响纤维素酶的生物活性[2]，[3]。

有研究表明，高温会导致酶蛋白氢键或疏水作用破坏，使酶可逆热伸展，酶的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。

同时周围水的存在会增加酶的“柔性”，从热力学角度考虑不利于酶的稳定[4]。

为提高纤维素酶的热稳定性，研究者在酶液中添加海藻糖、蔗糖和葡聚糖等糖类做酶保护剂，在干燥和高温保存过程中，海藻糖能减少纤维素酶在热处理过程中的热失活，同时也能提高纤维素酶高温存放过程中的酶活。

分析认为，海藻糖作用机理是羟基能替代水分子同酶结合，并且能在酶分子空隙中和酶分子周围形成玻璃态，将酶分子支撑和包裹起来。

因此，海藻糖能在较宽的温度范围内阻止酶分子空间结构发生变化，从而提高酶的热稳定性[5]，[6]。

海藻糖在中式火烧中的应用研究

海藻糖在中式火烧中的应用研究

海藻糖在中式火烧中的应用研究
海藻糖是一种天然的食品成分，具有甜度高、热稳定性好等特点，因此在中式火烧中有广泛的应用。

1. 增加甜度：海藻糖可以作为一种甜味剂，用于调节火烧的甜度。

与传统的砂糖相比，海藻糖更甜，添加量可以相对减少，以达到口感更加柔和的效果。

2. 增加稳定性：海藻糖具有较好的热稳定性，可以在高温下保持甜味稳定。

在烘烤过程中，海藻糖能够保持火烧的甜味不易流失，使火烧口感更加均衡。

3. 增加水分保持性：火烧制作过程中可能会出现水分流失的情况，海藻糖可以作为一种保湿剂在一定程度上增加火烧的水分保持性，从而使其更加湿润。

4. 提升口感：海藻糖在火烧制作过程中可以增加火烧的咀嚼感，使火烧更加酥脆，口感更佳。

值得注意的是，海藻糖具有一定的保湿性能，但添加过多可能会导致火烧过分潮湿或黏性增加，需要根据具体配方进行适量添加。

此外，海藻糖也有其自身的热稳定温度，过高的烘烤温度可能会降低其甜度和稳定性，因此需要控制好烘烤温度和时间。

总之，海藻糖的应用可以为中式火烧增加甜度、稳定性和口感，提高火烧的整体品质。