绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达

分子生物学综合实验论文题目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达

中国·黄石

2010年12月

绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达

胡丽丹

（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）

摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam H I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。

关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母

CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein Gene

HU Li-Dan

( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,

Hubei Normal university ,Huangshi 435000)

Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,has

been found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam H I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.

Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin

目录

1.前言： (1)

1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） (1)

1.1.1 GFP研究背景 (1)

1.1.2 GFP研究应用 (2)

1.2基因的克隆与表达 (3)

2.实验试剂及实验仪器： (5)

2.1实验试剂与材料： (6)

2.2实验仪器： (7)

3.实验方法 (7)

3.1质粒提取方法: (7)

3.2琼脂糖凝胶电泳及回收: (9)

3.3酶切及连接： (11)

3.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入： (12)

3.5酶切验证重组质粒： (13)

3.6GFP基因的表达 (14)

3.6.1活化菌种 (14)

3.6.2扩大培养 (14)

3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达 (14)

4.结果与分析 (14)

4.1质粒提取过程中现象与结果： (14)

4.2琼脂糖凝胶电泳 (15)

4.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果： (16)

4.4酶切验证重组质粒 (16)

4.5GFP基因的表达结果： (17)

5.讨论： (18)

5.1提取质粒出现图六的原因是： (18)

5.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： (18)

5.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因: .. 19 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因： (19)

5.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： (19)

6.参考文献 (20)

前言：

1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）

1.1.1 GFP 研究背景

绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。日本科学家下村修 1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白, 如图一所示。

这种蛋白在紫外线光中呈现绿色, 这种水母

体内含有一种生物发光蛋白质

——aequorin ，但它本身发蓝光,通过对光谱

的研究, 下村修提出了发光景水母所发的绿

光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白

发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体, 而绿色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的应用, 但水母素是荧光酶的一种, 它需要有荧光素底物, 经过

酶促反应后发光。GFP 能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、 钨丝下呈黄色、 紫外光下呈现强烈绿色[2]。

1987年，道格拉斯•普莱沙（Douglas Prasher ）克隆出了GFP 的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上，马丁•沙尔菲（Martin Chalfie ）成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生GFP ，这不仅证实了GFP 与活体生物的相容性，还建立了利用GFP 研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。

此后，谢尔盖•路基亚诺夫（Sergey A. Lukyanov ）又从一种珊瑚中分离出了与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的颜色。美籍华人钱永健（Roger Y . Tsien ）系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理，。钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现, 为研究蛋白之间的图一：夜晚水母体内GFP 显色[4] Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night [4]