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南方医科大学绿色荧光蛋白的克隆实验报告年级专业 2014级生物技术姓名朱旭峰学号 3147020042摘要细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
Cloning of green fluorescent proteinAbstract：Bacterial plasmid is a kind of double chain, closed-loop DNA, ranging from 1KB to 200kb. All plasmid is present in the cytoplasm, independently from the chromosome of autonomously replicating genetic component, usually under the condition of sustainable and stable in staining in the free state, but under certain conditions will irreversibly integrated into the host chromosome, with the replication of the chromosome replication and by cell split passed on to future generations.Plasmids have become the most commonly used gene cloning vector molecules, the important condition is to obtain a large number of purified plasmid DNA molecules. There are many methods can be used to extract plasmid DNA, the following are mainly introduced the method of extracting plasmid DNA by alkaline lysis method.关键词 GFP 质粒提取感受态细菌细菌转化1.前言碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
内蒙古大学生命科学学院生物系
基因工程实验室
本科基因工程大实验开题报告
论文题目：绿色荧光蛋白基因表达载体的构
建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名：
年级：
专业：生物技术
指导教师：苏慧敏
2012年 7月30日
1.2.11学习SDS-PAGE胶的基本灌制方法和用SDS-PAGE检测表达蛋白
1.3拟解决的关键问题：
1.3.1 pEGFP-N3载体和表达载体pET-trx质粒DNA的小量制备质粒制备的浓度与纯度直接影响后续实验步骤。
1.3.2 PCR扩增EGFP小片段 PCR扩增EGFP小片段需要高度特异性，所设计引物直接影响PCR结果。
我们所用引物为实验室多年使用引物，并由专业生物公司合成，可以解决该问题。
1.3.3 感受态细菌的转化能否成功将表达载体转化进感受态菌株以及转化率影响目的蛋白的产量。
2．实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
2.1实验思路与技术路线
注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
学号：班级：姓名：《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告实验课题：绿色荧光蛋白的基因克隆及表达指导老师：作者姓名：所在院系：小组编号：小组成员：完成时间：成都医学院Cheng Du Medical College题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。
1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。
而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
分子生物学综合性实验结题报告绿色荧光蛋白基因左xx1学 10110902014 10110904007 班 10G20专生物制药学生物医药摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。
本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification.Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；1..引言 ------------------------------5页2..应用前景 ------------------------------6页3..分子生物学实验原理 ------------------------------8页4..实验材料及试剂 ------------------------------12页5..实验流程 ------------------------------13页6..实验结果 ------------------------------19页7..分析 ------------------------------21页参考文献 -------------------------------22页致谢 ------------------------------ 23页附录 -------------------------------24页绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于水母﹑水螅何珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,这种蛋白质最早是由普林斯顿大学的科学家下村修（Osamu Shimomura）等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达开题报告毕业论文开题报告生物技术增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达一、选题的背景与意义随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶( secreted embryo alkaline phosphatase，SEAP)基因、β-半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β-葡糖苷酸酶(glucosidase，GUS)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase，LUC)基因等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。
而绿色荧光蛋白基因作为一类新型的报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光。
作为报告基因，GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。
而且新的研究表明，GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使。
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，且EGFP具有敏感的标记检测率，又无放射性的危害，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。
目前，在利用一些原核表达载体进行基因表达研究，常常遇到外源基因表达与否不能迅速得知，纯化过程中对各分离组分需进行多次电泳检测，才能进行后续工作，花费大量时间。
因此，构建以绿色荧光蛋白为标记的原核表达载体能够为外源基因表达的检测提供一种简单而直观的方法。
本课题旨在利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体pET-28a-EGFP，并了解该载体的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。
二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：基本内容：（1）设计引物，通过PCR法扩增EGFP目的片段；（2）将EGFP目的片段与pMD19 T-Vector连接，构建pMD19-EGFP载体；（3）将pMD19-EGFP与pET-28a双酶切，回收大小片段之后连接，构建pET-28a-EGFP载体；（4）将pET-28a-EGFP重组载体转化至大肠杆菌，获得转EGFP基因的大肠杆菌；（5）IPTG诱导，并在诱导不同时间观察转EGFP基因大肠杆菌中绿色荧光蛋白的表达量。
分⼦⽣物学实验报告分⼦⽣物学实验报告----绿⾊荧光蛋⽩(GFP)基因的克隆、表达和纯化⼀、实验背景绿⾊荧光蛋⽩（green fluorescent protein，GFP）是⼀类存在于包括⽔母、⽔螅和珊瑚等腔肠动物体内的⽣物发光蛋⽩。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿⾊荧光。
它产⽣荧光⽆需底物或辅因⼦发⾊团是其蛋⽩质⼀级序列固有的。
GFP由3个外显⼦组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋⽩，相对分⼦质量为27.0 kMr，其蛋⽩性质⼗分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。
发⾊团是由其蛋⽩质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly⾃⾝环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。
实验使⽤的EGFP蛋⽩取⾃原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋⽩质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进⾏扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进⾏表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动⼦与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP 编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；⼀个由SV40 早期启动⼦启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动⼦可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (7)5.3.1 双酶切 (7)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (12)6.TE缓冲液（P H8.0） (12)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
3 结果与分析3.1质粒提取用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。
得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。
1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。
3.2双酶切用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。
1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。
4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。
3.3 抗性筛选通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒受态细胞。
转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。
因为28a中含有抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。
从图中可以看出1号平板长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。
2号平板无菌落生长，说明DH5α中不含抗卡那基因。
3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。
4号板无菌落生长。
失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。
其二可能是在转化过程中，离心后，弃上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。
图3重组质粒转化DH5α感受态细胞1号图为不含卡那的阴性对照2号图为含卡那的阴性对照3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照4号图为含卡那的连接产物结果3.4PCR鉴定经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基因。
湖北师范学院分子生物学综合试验论文论文题目绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达作者姓名樊恒达专业名称生物技术准考证号2008114020308指导教师王友如中国·黄石绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达樊恒达（湖北师范学院生命科学学院0803班学号：2008114020308，湖北黄石）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱法提取质粒的方法提取质粒pET-28a-GFP。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对酶切后的质粒进行电泳，用以确定已经提取的质粒中含有GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
最后用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
结论：本实验对学生掌握最基本的分子生物学试验技术奠定了基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化Green Fluorescent Protein (GFP) Gene Cloning and ExpressionFan Hengda(class 3 grade 8, college of biology science ,Hubei Normal university, Huang Shi) : AbstractObjective:searching for the phenomenon of green fluorescent protein gene’s cloning and restructuring expression in the E.coli .Method:drawing plasmid pET-28a-GFP from E.coli DH5ɑ by using the method of Alkali Distillation .Then the selected production can be electrophored by using the AGE ,in order to make sure drawing successfully plasmid from E.coli. The selected plasmid is cutting by the extinction enzymes BamHI and NotI and the sliced plasmid can be electrophored by using the AGE in order to ensure the selected plasmid containing GFP gene .Converting the plasmid having gene of GFP into the feeling states E.c oli BL - 21 cells and cultivating it largely through the LB medium .Finally the IPTG can guide the expression of GFP gene and we can see light green clonies .Conclusion:This experiment sets up foundation for students to master the basical experimental technology of molecular biology .目录引言 (3)材料与方法 (3)1材料 (3)1.1材料 (3)1.2仪器 (3)1.3试剂 (3)2方法 (3)2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建 (3)2.2碱法提取质粒 (4)2.3质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 (4)2.5.E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化 (4)2.6 扩大培养 (4)2.7 GFP蛋白的诱导表达 (5)结果 (5)1实验现象 (5)1.1 碱法提取质粒 (5)1.2碱法提取质粒电泳 (5)1.3酶切质粒电泳 (5)1.4重组质粒的转化及阴阳性对照 (6)1.5 GFP蛋白的诱导表达结果 (6)1.6 紫外灯下看到的绿色荧光蛋白 (7) (7)讨论 (7)参考文献 (8)引言：2008年10 月 8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白（GFP）的发现者和推广者。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋20杨晨20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
二、实验流程三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。
它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达李宏远 2014236053立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。
1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。
而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
【研究意义】研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
GFP的应用特点检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
实验题目包含的内容本实验的目的是通过BamH I和Not I两种限制性内切酶的消化把EGFP基因从pEGFP-N3质粒中克隆出来，或者用PCR方法把EGFP基因从pEGFP—N3质粒中扩增出来。
并定向插入到表达载体pET-28a质粒的多克隆位点(MCS)中，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG 的诱导下表达出带有N端His-Tag的融合蛋白。
表达了GFP的菌体在离心管中则会呈黄绿色，在紫外光激发下发射出特异的绿色荧光，从而证明了目的蛋白的表达是否成功。
另外在菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中如果出现了明显的诱导条带，则条带中蛋白浓度与诱导时间呈正相关。
【根据现有的知识和技能来设计进行实验】1.查询两个质粒特点的资料：•pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移(荧光波长较大)变异体蛋白，具有更强的荧光(在485nm激发下比野生型强35倍)和在哺乳动物细胞中有较好的表达。
激发峰在488nm，发射峰在507nm。
•pET-28a质粒载体上面携带一个N-terminal His Tag／Thrombin／T7 tag结构以及一个可以选择的C-terminalHisTag。
克隆表达区域的编码框由T7RNA聚合酶转录。
2.根据查询的资料，确定两种途径可以到达目标第一种方法：用限制性内切酶方法，如果选定内切酶的方式去做实验，如何选择内切酶，选哪种内切酶即合用又经济。
根据两个质粒结构的特点，要在多种内切酶中进行选择，考虑pEGFP片段完整又考虑到被克隆的目标载体表达区域的编码框正确性。
使用Notl酶，Bamhl 酶，这是一对最合适的内切酶。
第二种方法：用PCR基因扩增方式达到目的。
如果用PCR方法去做实验，必需根据pEGFP的序列设计引物。
【实验原理】1.质粒重组：先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
2.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR 技术是Kary Mullis 在1985 年建立起来的在细胞体外合成DNA 的一种方法。
依DNA 半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA 模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA 片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA 的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5'端限定的特异性片段形成指数式积累。
整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特意的DNA 拷贝，这一特点使PCR 技术很快被应用到了分子生物研究的广大领域[3]。
【参考文献】[1] 梁国栋. 最新分子生物学实验技术[ M] . 北京: 科学技术出版社, 2001, 174.[2] 贾艳华，李国勋，张杰荧光蛋白及其应用[3] 魏春红，李毅主编聚合酶链反应----PCR 现代分子生物学技术高等教育出版社，2006.7:45-46【研究方案】通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，根据观察是否可以看到显现绿色，判断GFP基因是否在大肠杆菌中成功表达。
【关键词】绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达【技术路线及实验方案】【实验材料及试剂】注：最初始的两个质粒pEGFP-N3质粒，pET—28a质粒。
1.实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not Ⅰ。
2.实验试剂SIM-f140 SANYO Eppendof离心机电泳仪电子天平台式离心机控温磁力搅拌器调温电热套pH计冰箱台式冷冻恒温振荡器手提紫外灯生物洁净工作台琼脂糖凝胶电泳电泳装置电热恒温水温箱凝胶成像分析系统酒精灯培养皿移液枪枪头接种环酒精棉球灭菌枪头Parafilm膜离心管IceMaker【实验方法】•重组质粒的构建•DH-5α和BL-21感受态细胞的制备•感受态细胞的转化•碱法提质粒•酶切鉴定•琼脂糖凝胶电泳•PCR-聚合酶链式反应•Pet-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21•重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达【具体实验步骤】1. 重组质粒的构建重组质粒pET-28a-GFP的构建流程2. DH-5α和BL-21感受态细胞的制备1)将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
2)将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
3)取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
4)弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
3. 感受态细胞的转化取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
3) 42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
4) 加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。
4.碱法提质粒1）感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。
2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。
3) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。
4) 向离心管中加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。
5) 加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。
6) 加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。
7) 用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。
8) 加等体积氯仿400 μl抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。
9) 吸取上清液300 μl，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。
10) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。
向已干燥的离心管内加20 μl超纯水溶解质粒DNA，加入2 μl 10 mg/ml RNA酶，37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存。
5. 酶切鉴定1)取提取的质粒8 μl于另一微量离心管中，加入2 μl Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。
2) 离心，使溶液聚集在管底部3) 37 ℃，酶切反应。
6. 琼脂糖凝胶电泳1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 ℃左右。
2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。
3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。
4) 吸取10 μl的质粒与2 μl的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。
