诱导多能干细胞的研究进展
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・综述与专论・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年第9期
诱导多能干细胞的研究进展张鹏(北京林业大学生物科学与技术学院,北京100083)
摘 要: 体细胞诱导成为多能性干细胞(inducedpluripotentstemcell,iPScell)的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。在短短3年多的时间里,这项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展,而且,这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。从iPS细胞的研究历程、iPS细胞的构建机理、iPS细胞研究的最新应用成果以及iPS细胞的发展前景和研究方向等方面进行了评。关键词: 体细胞 多能干细胞 重编程 外源因子
ProgressonInducedPluripotentStemCellsZhangPeng(CollegeofBiologicalSciencesandBiotechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing100083)
Abstract:
Theresearchoninducingsomaticcellsintopluripotentstemcellshasbeenseenasdramaticbreakthroughsintheex2
plorationofmechanismofthediseaseandapplyinginclinicalmedicinewithinthree2yeartime.Moreover,theappearanceofthisnon2cloningstemcelltechnologysuccessfullyavoidthelong2vexedquestionofethics,isastrongimpetustothefieldandrelatedscientificfields.ThepaperfocusedonseveralaspectsofiPS,includingtheresearchcourse,constitutionmechanism,thelatestapplication,anddevelopmentprospects.Keywords: Somaticcells Pluripotentstemcells Reprogramming Exogenousgene
收稿日期:2009204209
作者简介:张鹏(19872),男,本科生,研究方向:细胞生物学;E2mail:zhangpengdyx@163.com
1 iPS细胞的研究概况111 细胞重编程细胞重编程是指成熟细胞由分化的状态被逆转到一种未分化状态的过程[1]。在核移植实验中被发现的细胞重编程现象,证明了体细胞能够被逆转到全能的状态,并且可以用于区分遗传学和表观遗传学的变化。目前,已经有多种实验方法可以实现体细胞的重编程。体细胞核转移技术(somaticcellnucleartrans2fer,SCNT)是研究较早的体细胞重编程技术,它是将体细胞核移入去核卵母细胞中,经过培养,核移植后的细胞会经历一个重编程的过程,逆转到全能的状态。经过多年的研究,人们利用这种方法已经获得了多种核移植动物,也建立了来源于核移植胚胎的胚胎干细胞系。然而,此项技术具有很多的局限性:
实验条件要求高、技术繁杂;克隆的效率很低;涉及到胚胎的破坏,有伦理道德的限制。其次,将成熟的体细胞与胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)等具有多潜能的细胞融合,也可以在一定程度上使体细胞发生重编程[2,3]。Cowan等[4]发现,用病毒和聚乙烯乙二醇使ES细胞
与皮肤成纤维细胞融合,能获得稳定的杂交细胞,这种杂交细胞的分裂方式、细胞周期等与ES几乎一样,拥有ES的特征物质并能在一定药物诱导下分化为各种组织细胞。但这种方法也存在着明显的弊端,即体细胞与多能性细胞的染色体共存于一个细胞核中,使得融合的细胞具有两套染色体。同时,此项技术还面临着融合效率偏低,移植后会发生排斥现象等很多难以突破的技术障碍。多能细胞的提取物与体细胞共孵育也可一定程2009年第9期张鹏:诱导多能干细胞的研究进展度上的实现体细胞的重编程。Taranger等[5]的研究表明,使用多能细胞的提取物来诱发体细胞重编程,能驱动体细胞新的基因表达模式。这种方法为研究体细胞重编程的调控机理开辟了新的途径,但目前还存在一定的争议,而且技术手段不成熟,所诱导的重编程效果也十分有限。此外,最近的一些研究也表明,多能性干细胞还可以由某些类型的细胞在体外培养时自发产生。Jiang等[6]发现,成年动物骨髓来源的细胞能在长期体外培养后形成多能性成体前体细胞(MAPCs)。精原干细胞在体外培养时偶尔能形成类似ES细胞的多能性干细胞的现象也相继被发现[7,8]。总结上述方法,其重编程的效率和程度都非常有限,而且由于受到实验条件和政策的严格限制,发展和应用一直难以寻得突破,这使得科学界希望寻找到一种实用性强,又不会引起伦理争端的细胞重编程手段。iPS细胞的构建方法是,通过导入与多能性相关的外源因子诱导体细胞核发生重编程,从而使体细胞转变成多能性干细胞。这是一种具有很强创新性的研究方法,与之前的方法相比,简便易行,重编程的效率和程度也都有了很大的提升。更重要的是,摆脱了材料来源和伦理学的诸多限制,因而该研究成果自诞生就引起了生命科学领域一次巨大的轰动,对今后重编程研究的发展也起到强有力的推动作用。112 iPS细胞的研究简史Takahashi和Yamanaka[9]将24个候选基因的cDNA序列分别装入逆转录病毒载体,将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和鼠尾成纤维细胞(TTF),在小鼠胚胎干细胞(ES)的培养条件下培养,结果发现被Oct4、Sox2、c2Myc和Klf44种基因组合感染的细胞获得了Fbx15+的多潜能干细胞系,该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物等方面与小鼠ES细胞非常相似,研究小组将这种细胞命名为诱导性多能干细胞(iPScell)。将iPS细胞注射到先天免疫缺陷的裸鼠皮下,得到包含三胚层细胞的畸胎瘤,进一步证明它具有类似ES细胞的发育潜能。这一研究成果于2006年8月发表后,立刻引起了研究iPS细胞的热潮。一年后,另一研究小组Wernig等[10]证明了iPS细胞的实验可靠性,并与Ya2
manaka研究小组[11]同时发现iPS细胞能够通过种系
传递,他们使用Oct4或者Nanog的内源性表达作为筛选标志取代了最初的Fbx15,得到的iPS细胞在形态学、基因表达状况和表观遗传修饰方面都与ES细胞十分相似。此外,这些iPS细胞可以产生嵌合小鼠,并能够嵌合到生殖系中。随后,另外两项研究相继报道了利用形态学作为筛选标准来建立iPS细胞的方法,这一方法在建立人类iPS细胞的研究中具有潜在的优势[12,13]。2007年11月,两个研究小组同时宣布,人类体细胞被成功诱导为多能干细胞。Takahashi等[14]是利用慢病毒载体携带他们在小鼠实验中使用过的4
种因子,实现了人类皮肤成纤维细胞的重编程;而Thomson的实验小组[15]则独立从14种ES高表达
基因中筛选出4种基因Oct4,Sox2,Nanog和Lin28,
转入胎儿和幼儿成纤维细胞后获得类ES细胞。随后,Daley小组[16]用实验手段排除了iPS细胞来自成纤维细胞中混有的极少量成体祖细胞的可能。来自中国的邓宏魁等[17]通过将多种因子联合4个基本的转化基因OCT4,SOX2,KLF4和c2MYC
诱导iPS细胞,再经过一个筛选平台对多种因子进行筛选,结果发现有2种因子p53siRNA和UTF1可提高iPS的转化效率达到100倍。目前,iPS细胞的建立方法已经有了明显的改善,并且其安全性也在不断的提高,很多研究更是成功地将其应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗,说明这一方法具有较高的可操作性和稳定性,
对将来的医学研究和临床应用极具价值。2 iPS细胞的构建iPS细胞的建立主要包括3个过程:将几个重要的多能性相关基因导入已分化细胞中;通过药物或形态学特征对转染的细胞进行筛选;对iPS细胞进行鉴定,证明其具有多能性。211 诱导因子Oct24和Sox2都是典型的多能干细胞特异转录因子。Oct24只在未分化的胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)和胚胎生殖细胞(EG细胞)中表达,当这些细胞被诱导分化为体细胞时,Oct24
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表达下降[18],由此可见,Oct24在动物胚胎发生中是一个关键的调控因子,而且可能在维持细胞的全能性及未分化状态中起着重要的作用。Sox2的表达则并不局限于多能性细胞,但其对早期胚胎发育和抑制分化起着十分重要的作用。Sox2在胚胎发育过程中存在两个表达高峰,即囊胚内细胞团(ICM)和神经干细胞时期,Sox2在这两种细胞中的高表达与维持该细胞的状态并抑制细胞分化密切相关[19,20]。有研究表明,Sox2基因敲除的小鼠能发育至囊胚(可能与母源蛋白的持续存在有关),但不能形成上胚层[21]。c2Myc为卟啉2原癌基因,它是Lif/STAT3和Wnt信号通路的一个主要的下游基因,这两条信号通路对于多能性的维持都很重要,其强制表达诱导ES细胞分化和凋亡[22,23]。C2Myc可以激活转录,调节包括细胞分裂和增殖相关基因的表达,从而打开整个染色质结构,此外还调节非编码RNA的表达[24,25]。Klf4既是原癌基因又是抑癌基因,它的过表达可以维持Oct4的表达,并抑制ES细胞的分化[26]。Klf4的强制表达可以促进小鼠ES细胞的自我更新,而在体细胞的表达中强制表达可抑制DNA的复制,阻滞细胞周期处于G1/S期[27]。因此,它在细胞增殖和分化之间起开关作用。ES细胞的基因组有着很高的可塑性,其染色质结构比较开放,具有转录活性,而体细胞的基因组可塑性比较差,c2Myc可以诱导体细胞染色质结构发生改变。因此可以合理推测,在重编程过程中,最初由c2Myc将关闭的染色质打开,以便其他因子结合开放的染色质,Klf4,Sox2和Oct4等因子得以对靶基因的转录进行调节,通过它们的相互作用诱导细胞进入多能状态。Thomson等的研究是通过Oct4,Sox2,Nanog和Lin28这4个基因的组合导入来实现人类成纤维细胞转变为iPS细胞,说明iPS细胞的产生可以通过不同的因子组合来诱导。这4个因子是否与Ya2manaka小组的4个因子有着相似的作用方式还不得而知,目前,人们对于转导因子诱导的重编程的机理研究还刚刚开始。212 iPS细胞的筛选在导入相关基因之后,诱导的过程中,挑选可能具有了多能性的细胞对于整个工作来说至关重要,
