使 用 说 明 书 - 250 bp DNA Ladder Marker

CASK基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定覃觅;孙宇;刘俊;王延宁;赵文;周华富【摘要】Objective:To construct a lentiviral vector over-expressing calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase (CASK).Methods:The whole length CASK gene fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into linearized GV358 lentiviral vectors using ligase.Positive clones of CASK-GV358 vectors were identified by PCR.The lentiviral vectors containing CASK gene were co-transfected into 293T cells with packaging plasmids.The virus titer was determined by ELISA.The recombinant lentivirus over-expressing CASK (LV-CASK) and negative control recombinant lentivirus CON238 were used to infect human NSCLC H1299 cells,respectively.Fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) and western blotting were used to detect the expression of CASK.Results:CASK gene was amplified and successfully inserted into the GV358 lentivirus vector.The sequences of the recombinant plasmid were confirmed by PCR and DNA sequencing.The expression of GFP could be detected in 293T cells infected with recombinant lentiviruses.The lentiviruses over-expressing CASK were harvested and concentrated to 2 × 108TU/mL.According to the results of FQ-PCR and western blotting,the mRNA and protein expression level of CASK significantly upregulated in H1299 cell infected with LV-CASK,compared to cells infected with CON238 (P ＜0.05).Conclusion:The lentivriral vector over-expressing CASK gene was constructed successfully and stably expressed CASK in H1299 cells.%目的:构建人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)基因过表达慢病毒载体并进行鉴定.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增CASK基因片段,通过连接酶将CASK基因片段连接至线性化的GV358载体上,运用PCR方法鉴定阳性克隆的CASK GV358载体;将重组质粒和包装质粒共转染至293T细胞,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行滴度检测.将成功包装的CASK过表达慢病毒LV-CASK(OE组)和阴性对照病毒CON238(NC组)分别感染人非小细胞肺癌(NSCLC)H1299细胞,同时设空白对照组(MOCK组),用荧光定量PCR(FQ-PCR)和western blotting法检测CASK表达水平.结果:通过PCR技术成功地扩增CASK基因片段并连接到GV358病毒载体上,PCR及DNA测序鉴定结果证明CASK-GV358质粒构建正确;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到绿色荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并测定其浓缩滴度为2×108TU/mL.FQ-PCR和western blotting检测结果显示,与NC组相比,OE组CASK mRNA和蛋白的表达均显著上调(P＜0.05).结论:成功构建CASK基因过表达慢病毒载体,可在H1299细胞中稳定表达,为CASK基因的后期研究提供了实验基础.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2017(034)005【总页数】4页(P684-687)【关键词】CASK;慢病毒;载体构建;过表达【作者】覃觅;孙宇;刘俊;王延宁;赵文;周华富【作者单位】广西医科大学第一附属医院,南宁530021;广西医科大学第二附属医院,南宁530007;广西医科大学第一附属医院,南宁530021;广西医科大学第一附属医院,南宁530021;广西梧州市人民医院,梧州 543000;广西医科大学第一附属医院,南宁530021【正文语种】中文【中图分类】R349.8人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase，CASK)属于膜相关鸟苷酸激酶(membrane associated guanylate kinase，MAGUK)家族，广泛分布于多种组织和细胞，参与蛋白质的分子组织、细胞连接组装、转录调节、发育调节等重要的细胞生理功能。

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常州天地人和生物科技有限公司
DL5000 DNA Marker
产品信息 货号 规格
SDM201
500μl （约100次）
保存条件：4℃（长期保存请置于-20℃）。

产品说明：DL5000 DNA Marker 由9条带组成，分别为100、250、500、750、1,000、1,500、2,000、3,000、5000bp 组成，适合100bp 到5,000bp 的PCR 产物或DNA 片段的琼脂糖凝胶电泳。

其中500 bp 是指示带，显示亮带，条带浓度约为100ng/5 μl，其余条带浓度均约为50 ng/5 μl。

建议上样量：每孔3~5μl
储存缓冲液（1X Loading Buffer ） 组分
浓度 Tris-HCl (pH7.6) 10mM EDTA 1mM 溴酚蓝 0.005% 甘油 10%
注意事项：
● DL5000 DNA Marker 为已含有1X
Loading Buffer 的DNA 溶液，电泳时可以直接上样。

● 琼脂糖的纯度会影响DNA 条带的清
晰度，建议使用质量好的琼脂糖，推荐使用胶浓度为1.0-1.5%。

电泳条件：1.5%琼脂糖，上样量5μl ，胶孔宽度为6mm ，电泳缓冲液1X TAE ，8V/cm 。

Bmi-1基因过表达载体的构建【摘要】目的：在真核细胞中构建Bmi-1基因的过表达载体。

方法：从GenBank 中获取Bmi-1基因序列，设计针对Bmi-1的特异性引物，利用PCR方法获得全长目的基因，将目的载体和PCR产物进行双酶切，在T4DNA连接酶下形成重组质粒。

对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。

结果：经阳性克隆测序结果及结果分析，测序正确。

结论：人源Bmi-1真核过表达载体构建成功。

【关键词】 Bmi-1；过表达载体；转化前言：多梳基因( polycomb group genes,PcG)家族是果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子。

在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞的维持中有着重要的作用。

由荷兰癌症中心于1991年在鼠淋巴瘤中发现的Bmi-1基因( B cell-specific MLV inte-gration site-1 )是多梳基因家族中重要成员之一,参与干细胞的增殖、分化与衰老,在多种肿瘤形成过程中起重要作用[1]。

人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关), DNA大小为4. 9 kb, mRNA为3 199 bp,含10个外显子,编码含326个氨基酸的蛋白质,分子质量为36. 9 kD[2]。

其蛋白表达在细胞质、染色质或染色体。

Alkema等用鼠Bmi-1 cDNA片断作为探针从人白血病细胞中分离出Bmi-1并进行分析,发现其核苷酸序列与鼠的一致性达86 %,所编码的蛋白质的氨基酸系列与鼠的一致性达98 %。

Bmi-1基因含有一个环指模序,位于N-末端的环指结构域( ring fin-ger domain, RF),与抑癌基因c-Myc协同在细胞增殖和肿瘤形成中发挥作用。

Bmi-1通过环指结构与其他环指蛋白,如dinG等形成异源二聚体,再与其他成分相互结合,抑制其靶基因的转录[3]。

12分子量Marker210211212214215216216216217218218218219219219DNA 分子量Marker 图预混合的即用型DNA Marker DNA Step Ladders DNA Ladders 常用DNA Marker 放射自显影Marker 超螺旋DNA Ladder 染色体DNA Marker 荧光DNA Marker RNA Markers 蛋白Marker 体外翻译Marker 基因组DNA 上样染料其它常见水生植物(亚马逊河之剑)Echinodorus paniculatus 的花粉。

放大倍数：1325×。

单个花粉直径为25µm ，这些植物生长在水中，或露出水面，但是花蕾只在水上开放。

DNA 分子量Marker 图分子量Marker核酸分子量Marker说明: Promega 提供用于传统及脉冲电场凝胶电泳(PFGE )所需的范围广泛的DNA 及RNA 分子量Marker (molecular weight marker )。

传统双链DNA 电泳Marker 包括ladders ，限制性内切消化的lambda, φX174和pGEM ® DNA 。

蓝色/橙色上样染料与大多数DNA Marker 一同提供。

同时提供未消化的DNA (如, Lambda, φX174,pBR322等) 以用于自制分子量Marker 。

提供的RNA Marker 的大小范围为281到6,583个碱基。

PFGE 大小Marker 包含Promega-Markers ® Lambda Ladders 。

PFGE Marker 大小范围大约为50kb 到1.0Mb 。

提供的PFGE Marker 为储存于50mM EDTA 缓冲液的橙色琼脂糖系列条带。

Promega 同时还提供蛋白Marker 及体外翻译Marker 。

BenchTop DNA MarkersAgarose, LE, Analytical Grade24Ethidium Bromide Solution, Molecular Grade 29Wizard ®SV Gel and PCR Clean-Up System 92– 1,353bp– 1,078– 872– 603– 310– 281/271– 234– 194– 118– 722% agarose3176T A 12_0ABenchTop φX174 DNA/HaeIII Markers Cat.# G7511 Load 5µl/lane.– 2,645bp– 1,605– 1,198– 6762% agarose– 517– 460– 396– 350– 222– 179– 126– 75/65 [51,36]3177T A 12_0ABenchTop pGEM ®DNA Markers Cat.# G7521 Load 5µl/lane.bp – 1,000– 750– 500– 300– 150– 502% agarose0094T A 05_3ABenchTop PCR MarkersCat.# G7531 Load 6µl/lane.bp– 250, 253– 500– 750– 1,000– 1,500– 2,000– 2,500– 3,000– 4,000– 5,000– 6,000– 8,000– 10,0000.7% agarose1409T A03_6ABenchTop 1kb DNA LadderCat.# G7541 Load 6µl/lane.bp – 1,500– 1,000– 900– 800– 700– 600– 500– 400– 300– 200– 1002% agarose0973T C 03_5ABenchTop 100bp DNA LadderCat.# G8291 Load 6µl/lane.预混和的即用型DNA Marker分子量Marker说明: BenchTop DNA Markers 可以方便地储存于室温(22-25℃)，并可以在琼脂糖凝胶上直接上样。