宜昌百合的组织培养研究

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宜昌百合的组织培养研究熊 丹,陈发菊,梁宏伟,王玉兵,张德春(三峡大学生物技术研究中心/湖北省天然产物研究与利用重点实验室,湖北宜昌443002)

摘要:试验以宜昌百合的鳞茎为外植体,研究宜昌百合组织培养快繁的最佳方法。结果表明:宜昌百合鳞茎的最适诱导培养基为:MS+62BA110mg・L

-1+NAA210mg・L-1

,添加20%的椰乳和015%的活性炭,同时可以有效地防止宜昌百合在

培养时产生褐化;较适的生根培养基为:1/2MS+016mg・L

-1

IBA+015%AC。该实验结果为宜昌百合的快速繁殖及工业

化生产提供了理论基础和技术支持。关键词:宜昌百合;组织培养;激素;活性炭;椰乳中图分类号:S68212 文献标识码:A 文章编号:1002-7351(2007)04-0091-04

StudiesonthetissuecultureofLiliumleucanthum

XIONGDan,CHENFa2ju,LIANGHong2wei,WANGYu2bing,ZHANGDe2chun(BiotechnologyResearchCenterofThreeGorgesUniversity;HubeiProvincialKeyLaboratoryofNatural

ProductResearchandUtility,Yichang,Hubei443002,China)

Abstract:TodevelopasuitableapproachfortherapidpropagationofLiliumleucanthumbytissueculture,bulbsweretriedastheexplant.TheresultshowedthatthesuitablemediumforthebulbexplantculturewasMS+62BA110mg・L-1+NAA2.0mg・L-1,suppliedwith20%coconutmilkand0.5%activatedcharcoal(AC)whichpreventedfrombrowning;Thesuitablerootingmediumwas1/2MS+0.6mg・L-1IBA+0.5%AC.TissuecultureofLiliumcanachieveitsrapidpropagation,resultinginthepossibilityforitsindustrialproduction.Keywords:Liliumleucanthum;tissueculture;hormone;activatedcarbon;coconutmilk

百合(Liliumspp1)是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)

的所有种类的总称。百合

是著名观赏花卉,还是上等的保健食品,具有润肺滋阴、清心安神的药用功能。中国是百合植物资源的自然分布中心,全世界百合属植物约100种,其中中国原产47种以上,种类丰富,珍稀特有种多[1]。宜昌百合(L1leucanthum)主要产于湖北西部,花大美丽,清香益人,具有极高的观赏价值,宜昌百合仍处于野生状态,野生百合具有内生病毒少,抗病能力强的优点,也是很好的育种材料。自Robb首次报道了百合组织培养之后[2],组织培养方法已成功用于多种百合植物的大量繁殖,并在百合育种和遗传转化中得到应

用[3,4]。宜昌百合的相关研究报道很少,仅见王 对宜昌百合进行了小鳞茎诱导的初步研究[5]。本文对宜昌百合进行组织培养快速繁殖研究,以期为该物种种质资源保护,建立高效的离体培养体系提供资料,

对保护和合理开发利用宜昌百合资源具有非常重要的现实意义。

1 材料与方法111 材料来源宜昌百合的鳞茎采自神农架自然保护区。112 实验方法剥去外层鳞茎选择健壮、无病斑、色泽光亮的鳞片,并按下述方法进行表面灭菌:流水中用软刷洗去泥沙,洗洁净液浸泡30min,自来水冲洗1h,蒸馏水冲洗2~3次,70%酒精表面消毒30s,011%升汞消毒

 收稿日期:2007-04-10

 基金项目:湖北省教育厅重点项目(NO.SD200216)和宜昌市科技局重点攻关项目(NO.A06209)资助 作者简介:熊 丹(1981-),女,湖北荆州人,三峡大学硕士生,从事生物技术研究。 通讯作者:陈发菊,Email:chenfj616@163.com。

第34卷第4期2007年12月福建林业科技JourofFujianForestrySciandTechVol134 No14Dec1,200710min,无菌水冲洗5次,置于带滤纸的无菌培养皿中,使滤纸吸干鳞片表面水分,于超净工作台上将鳞片切成015~110cm2的小块,接种到三角瓶中。每组10瓶,每瓶6片(3片凸面向上,3片凹面向上),置于组织培养室中培养,培养条件为:温度25℃±2℃,光周期分别为24h・d-1黑暗或12h・d-1光照+12h・d-1黑暗,光照度为1500lx。

基本培养基为MS培养基,琼脂8g・L

-1,蔗糖30g・L-1

,通过附加不同浓度的NAA、2,42D、62BA、

IBA、活性炭和椰乳设计了18组培养基组合。

2 结果与分析211 NAA、2,42D和62BA不同浓度配比对宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织和芽的影响接种于诱导培养基上的宜昌百合鳞茎培养5d后,外植体开始增厚变绿,形成一些淡绿色小突起,大约15d以后,有的淡绿色小突起开始直接分化成苗;有的膨大成无特定形态结构,颜色为淡黄绿色,表面呈瘤状突起的愈伤组织状。愈伤组织状结构在35~40d以后,表面形态开始发生变化,一些瘤状突起分化为次级小鳞茎,簇生,形状较规则,每个小块产生数目不同,少的1~2个,多的可达10~15个,颜色有乳白色、淡黄色、浅绿色、深绿色。进一步生长,多数可以长成苗,少数畸形、玻璃化。60d时进行统计,结果见表1。表1 激素组合及浓度对百合鳞片诱导愈伤组织和芽的结果培养基编号BA/mg・L-12,42D/mg・L-1NAA/mg・L-1出愈率/%出芽率/%生长状况10150120661740+++21100120501617++3015015066173313+4110015066170-501511008050+++611011001000-721011008020+81102100500-92102100500-1001500120100+++11110001266171617+++12015001525100+++13110001587151215++++140150110100100++15110011063167217++++1621001103313100++++17110021081187217+++++18210021066178313++3:-为没芽生成;+为有芽生成,但苗很不健壮;++为有芽生成,苗生长一般;+++为有芽生成,苗比较健壮;++++

为有芽生成,不是很旺盛,但苗很健壮;+++++为有芽生成,生长非常旺盛,苗很健壮。从表1可以看出,1~18号培养基中,较适合宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织的激素组合是6号和14号,

其次是13号和17号2种激素组合;促进宜昌百合鳞茎诱导芽效果最好的是14号和16号培养基,其次是15号、17号和18号3种激素组合;从苗的生长情况来看,17号激素组合诱导生成的苗的生长非常旺盛,没有畸形,且大部分很健壮,其次为13、15、16激素组合,16号激素组合诱导生成的苗的生长虽然没有17

号激素组合诱导生成的苗生长旺盛,但苗很健壮。从实验过程中,观察到虽然14号激素组合对诱导愈伤组织和芽的频率比较高,但诱导生成的苗生长不旺盛,也不健壮。综合出愈率和发芽率及苗的生长情况来看,适合宜昌百合鳞茎诱导生成愈伤组织和芽的激素配比是17号,即MS+62BA110mg・L

-1

+NAA210

mg・L-1,小鳞茎诱导迅速,诱导率高,突起明显,生长旺盛;其次为15号和16号激素配比,即MS+62BA

・29・福建林业科技第34卷110mg・L-1+NAA110mg・L-1和MS+62BA210mg・L-1+NAA110mg・L-1。其中5号、6号、7号、14

号和17号培养基适宜做宜昌百合鳞茎诱导生成愈伤组织的初代培养;13号、15号、16号和17号这4种培养基生长的小鳞茎或苗长势整体都很好,可以直接通过生根培养,然后移栽。从表1还可以看出,2,42D、NAA对诱导宜昌百合鳞茎形成愈伤组织有明显促进作用,与62BA配合使用,愈伤组织诱导率平均都在50%以上。但可以明显看出,62BA与NAA配合使用比62BA与2,42D配合使用对诱导宜昌百合鳞茎形成愈伤组织有很大的差异,62BA与2,42D配合使用明显优于62BA与NAA配合使用;在诱导宜昌百合鳞茎形成芽的激素组合中,62BA与NAA配合使用比62BA与2,42D配合使用更好些。可能原因是2,42D、NAA均为生长素,对于细胞启动脱分化阶段,2,42D的药剂活性作用最强,但是2,42D适宜的用量范围较窄,且过量的2,42D对百合的增殖常会有毒副效应,抑制芽的形成。因此在诱导宜昌百合鳞茎形成芽的激素组合中,62BA与NAA配合使用好于62BA与2,42D配合使用。这表明不同的激素组合对百合鳞茎诱导中62BA与NAA和2,42D配合,以附加NAA的效果优于附加2,42D的效果,前者分化率最高为75%,而后者最高仅为58%的,与姚连芳等[6]观点一致。212 暗培养和光培养对宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织和芽的影响宜昌百合鳞茎接种在诱导培养基上,黑暗培养15d后均形成颜色淡黄、质地疏松的愈伤组织,有的也直接分化出芽。在光照和黑暗培养条件下,宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织和芽有差异,具体情况如表2所示。在黑暗条件下愈伤组织生长的比较慢,当把在黑暗条件下培养的愈伤组织转到光照条件下培养,愈伤组织又逐渐变绿,愈伤组织的生成相对平均,较一直在光照条件培养的生成量多,生长速度较快,质地逐渐由疏松到致密;黑暗条件下诱导生成的苗较在光照条件下诱导生成的苗高,将黑暗条件下培养的苗转入光照条件下培养一段时间后,淡黄色的苗逐渐变成绿色,并且生长的比较健壮。表2 光培养和暗培养对宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织和芽的影响培养方式愈伤组织发生愈伤组织诱导情况再生芽萌生芽的生长情况光培养++淡绿色,质地由疏松到致密,颗粒状+++绿色,粗壮较短暗培养+++淡黄色,质地疏松,颗粒状++淡黄色,纤细较长3:++为发生率一般;+++为发生率较高。从表2中可以看出,在黑暗条件下培养有利于宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织的生成;在光照条件下诱导生长的愈伤组织没有在黑暗条件下诱导的多,但诱导生成的芽比较多。在实际生产过程中,对于在宜昌百合鳞茎诱导愈伤组织和芽的实验中,可以先选择在黑暗条件下培养一段时间,然后在光照条件下培养。213 添加剂对宜昌百合鳞茎增殖效果的影响将经过初代培养的宜昌百合鳞茎诱导产生的愈伤组织和不健壮的芽转入继代培养基中,继代培养基是MS+62BA210mg・L