螺旋藻耐盐相关基因启动子区功能分析

蝮　ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２０１１年１０月　ＩＳＳＮ　０２５３－９７７２　ＷＷＷ．ｃｈｉｎａｇｅｎｅ．ＣＲ　研究报告　

ＤＯＩ：１０．３７２４／Ｓ　Ｐ．Ｊ．１００５．２０１１．０１１３４　

螺旋藻耐盐相关基因启动子区功能分析　李姗姗　，雍静茹　，齐云玲　，章颖　，赵亮　，夏士林　，李东２王慧利１包其郁　，李佩珍　１．温州医学院检验医学与生命科学学院，温州３２５０００；　２．温州医学院生物学实验教学中心，温州３２５０００　

摘要：文章利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，研究２个螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的功能。通过启动　子预测软件预测螺旋藻耐盐相关基因５　端非翻译区的启动子结构，用Ｐｒｉｍｅｒ３．０程序在线设计Ｂ『物，以　ｐＭＤ１８一Ｔ载体和ｐＵＣ１８载体克隆螺旋藻启动子序列、　和卡那霉素抗性基因，将螺旋藻启动子．ＧＦＰ基因一卡　那霉素抗性基（ｐｒｏ一　一ｋａｎ　）三联ＤＮＡ片段克隆至ｐＫＷ１１８８载体，并将该重组质粒ｐＫＷｌ１８８：：ｐｒｏ：：ｇｆｐ：：ｋａｎ　转化至受体菌集胞藻６８０３，激光共聚焦显微镜观察不同盐浓度培养条件下、不同时间段集胞藻表达ＧＦＰ的情　况。结果显示，通过不同盐浓度和不同时间的诱导，２个螺旋藻启动子在０．４～０．６　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１条件下，培养６～８　ｈ　表达的绿色荧光蛋白最多。文章成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因、卡那霉素抗性基因为选择标记、集胞　藻６８０３作为外源基因表达受体，进行螺旋藻耐盐相关基因功能研究的平台；另外，从螺旋藻启动子能被盐诱导　大量表达ＧＦＰ的结果看，与启动子相关的螺旋藻基因很可能与螺旋藻的耐盐性相关。　

关键词：　绿色荧光蛋白；螺旋藻；启动子；集胞藻；耐盐相关基因　

Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓａｌｔ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　

ＬＩ　Ｓｈａｎ．Ｓｈａｎ　，ＹＯＮＧ　Ｊｉｎｇ．Ｒｕ　，ＱＩ　Ｙｕｎ—Ｌｉｎｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｙｉｎｇ　，ＺＨＡ０　Ｌｉａｎｇ　，ＸＩＡ　Ｓｈｉ—Ｌｉｎ　，ＬＩ　Ｄｏｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｈｕｉ—Ｌｉ　，ＢＡＯ　Ｑｉ—Ｙｕ　，ＬＩ　Ｐｅｉ．Ｚｈｅｎ　

１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＬａｂｔｏｒｙ　ａｎｄＬｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ　Ｍｅｄｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ　３２５０００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｔｅａｃｈｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆＷｅｎｚｈｏｕ　Ｍｅｄｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ　３２５０００，Ｃｈｉｎａ　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ，ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓａｌｔ・ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　Ｇｅｉｔ１．）ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ（ｇｆＰ）ａｓ　ａ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｓａｌｔ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｏｎｌｉｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｐＭＤ　１　８－Ｔ　ａｎｄ　ｐＵＣ　１　８　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ｋａ　ｇｅｎｅ．　Ｔｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏ－ｇｆｐ—ｋａｎ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＫＷ１　１　８８　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　ｈｏｓｔ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｐｅｖａｌｅｋｉｉ　Ｅｒｃｅｇｏｖｉｃ）ＰＣＣ６８０３．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｇｒｏｗｎ　ｕｎｄｅｒ　ｖａｉｌＯＵＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｆｏｒ　ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ．Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｏｂ　

收稿日期：２０１１－０３—２８；修回日期：２０１１－０５—１１　基金项目：国家自然科学基金项目（编号：３０５７１００９，３１０７１１１５）和浙江省科技计划项目（编号：２００９Ｃ３３０４０）资助　

作者简介：李姗姗，在读本科，专业方向：临床检验诊断学。Ｅ—ｍａｉｌ：４０３８５５７９７＠ｑｑ．ｃｏｍ　通讯作者：李佩珍，硕士，实验师，研究方向：分子生物学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｐｚ０５２２＠１２６．ｃｏｒｎ　网络出版时间：２０１１－８—２２　１０：０５：００　ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／１１．１９１３．Ｒ．２０１１０８２２．１００５．００４．ｈｔｍｌ　第１０期　李姗姗等：螺旋藻耐盐相关基因启动子区功能分析　１１３５　ｓｅｒｖｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｌａｓｅｒ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｏｕｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｇｒｏｗｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｆｏｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐｅｒｉｏｄｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｖａｒｙｉｎｇ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮａＣ１　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　０ｆ　０．４ｍｏｌ／Ｌ　ｔｏ　０．６ｍｏｌ／Ｌ　ｆｏｒ　６　ｔｏ　８　ｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｓ￣ｏｎｇｅｓｔ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｓａｌｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓ－　ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇ　，ｗｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ａｒｅ　ｌｉｋｅｌｙ　ｔｏ　ｐｌａｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｐｉｒｕｌｉｎａ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ，ｗｅ　ｂｅｌｉｅｖｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｌａｔｆｏｒｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｇｙｐ　ａｓ　ａ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ，ｔｈｅ　ｋａｎ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ，　ａｎｄ　Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ．ｓｐ．ＰＣＣ６８０３　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｈｏｓｔ．　

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｐｉｒｕｌｉｎａ；ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔ＆．ｓｐ．ＰＣＣ６８０３；ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　

螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属于蓝藻Ｉ＇］（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、蓝　藻纲（Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、颤藻目（Ｏｒｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）、颤藻　科（０ｓｃｉｌｌａｔｏｎｉａｃｅａｅ）、　螺旋藻属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ或　Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ），是一类进化历史悠久、革兰氏染色阴　性、无鞭毛、含叶绿素ａ（但不形成叶绿体）、能进行　产氧性光合作用的大型原核生物，广泛分布于自然　界的陆地、淡水域和海洋中，甚至在岩石表面也能　发现它们的踪迹。螺旋藻能够耐受强光、强碱和高　盐等极端条件，其最适钠离子浓度为１５０～２００　ｍｍｏｌ／Ｌ，可耐１　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１　ｌＪ，引。极强的耐盐能　力、简单的细胞结构以及便利的培养条件使人们对　螺旋藻的耐盐机理产生了浓厚兴趣，Ｗｉａｎｇｎｏｎ等【３］　发现Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ包膜存在钠诱导型　ＡＴＰ酶与蓝细菌的耐碱性有关，方孝东等【４　１认为　盐藻在受到高渗刺激时，转铁蛋白和碳酸脱水酶基　因表达增强。虽然国内外都开展了对蓝细菌抗盐碱　等抗逆性机制的研究，但迄今还没有学者从基因　组、蛋白组水平比较系统地研究螺旋藻抗盐碱分子　机理。前期研究中，在本课题组完成的螺旋藻全基　因组序列图的基础上，采用蛋白组学方法分离和鉴　定了螺旋藻耐盐胁迫反应相关蛋白，并通过质谱分　析筛选出螺旋藻在受到盐胁迫时差异表达最明显的　２个基因（本课题组未发表数据）。为进一步验证这２　个基因的功能，本研究中我们选择遗传背景清楚便　于进行基因序列和功能分析的集胞藻６８０３作为外　源基因表达受体，其全基因序列已经于１９９６公布ｌ７１，　以ｇｙｐ为报告基因，构建相应的集胞藻６８０３同源重　组双交换整合平台，开展启动子表达调控研究。通　过分析不同的启动子在集胞藻６８０３的相对转录起　始效率，为筛选高效表达启动子提供参考依据，为　拓建耐盐基因资源库，揭示耐盐分子机制，以及耐　盐植物的分子育种等进一步研究奠定基础。　１材料和方法　１．１材料　ｐＭＤ１８－Ｔ质粒、基因重组各种工具酶购自宝生　物工程（大连）有限公司，ｐＵＣ、ｐＥＴ．２８ａ质粒为本实　验室保存，ｐＫＷ１　１８８质粒为本校王慧利老师惠赠，　螺旋藻、大肠杆菌ＪＭ１０９为本实验室保存，含ＧＦＰ　基因的细菌为浙江大学吴敏教授惠赠，集胞藻购自　中科院武汉水生所，ＰＣＲ纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回　收试剂盒、质粒纯化试剂盒为艾思进公司产品，引　物合成由上海捷瑞公司完成，激光共聚焦显微镜　ＦＶ１０００购自日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，荧光分光光度计　ＲＦ．５３０１ＰＣ购白日本Ｓｈｉｍａｓｚｕ公司。　１．２　方法　１．２．１引物设计　根据螺旋藻耐盐性蛋白组研究结果，筛选出２　个在高盐（１　ｍｏｌ／Ｌ）环境下明显上调的螺旋藻基因（分　别命名为ｓｐｉ一０４９、ｓｐｉ．２９５）。根据螺旋藻基因组序列　的注释结果，找到这２个基因的对应基因组序列。　再用ｏｎｌｉｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ预测基因上游序列中的　启动子序列，用在线引物软件ｐｒｉｍｅｒ３．０设计２对扩　增启动子片段引物，扩增片段长度为２００和２５０　ｂｐ，　分别在各启动子引物上游５　端加入Ｘｂａ　Ｉ的酶切位　点，引物下游加入绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因５　端部分　序列（表１）；在ＧＦＰ基因的上游引物５　端加入启动子　３　端的部分序列，在ＧＦＰ基因的下游引物３　端加入　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ的酶切位点（表１）。在卡那霉素抗性基因引　物的上下游分别加Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ和ＨｉｎｄｌＵ酶切位点。