2009CB941100-诱导多能干细胞(iPS)的重编程机制

项目名称： 诱导多能干细胞（iPS）的重编程机制 首席科学家： 起止年限： 依托部门： 1

一、研究内容 基于以上的立项依据，本项目的主要研究内容将集中在以下几个方面： 1． iPS细胞被重编程的分子机制 从核移植（克隆动物的基础）我们得知，细胞核可以被胞质重编程。iPS的出现说明四个因子（或其他几个因子）可以重编程体细胞。目前我们不知道使重编程发生的关键分子事件是什么。我们将从表观遗传修饰的改变、microRNA的变化和基因表达谱的变化几个方面来研究iPS中重编程的分子机理。

1.1 表观遗传变化 基因表达活性调控的机制主要是通过染色质水平的化学修饰（包括组蛋白上的修饰），形成有转录活性的常染色质和无转录活性的异染色质区域。染色质组分（组蛋白与DNA）的各种修饰在细胞内由不同的酶类催化完成。胚胎干细胞、成体细胞或已分化细胞具有各不相同的特异性的染色质修饰谱式。这些修饰谱式在体细胞去分化时发生逆转（重编）。已有实验证明MEF细胞的Oct4和Nanog基因的启动子在iPS形成过程中发生去甲基化。由于DNA甲基化引起基因转录沉默，因此去除全能性基因上的DNA甲基化是激活全能性基因的重要步骤。也是iPS诱导过程中一系列分子事件中的一大限速步骤。同时，由于在转录调控中，DNA甲基化和组蛋白的修饰属于一起发挥作用的共同体，因此，研究DNA甲基化在iPS中的作用，必须要研究该过程中组蛋白修饰的变化。我们将在iPS诱导系统中，利用ChIP-on-chip芯片研究分析和发现组蛋白修饰的动态变化。在此基础上，通过有目的地改变DNA甲基化和组蛋白修饰的动态平衡，探索简化iPS诱导方法的可能策略，如不依赖反转录病毒导入外源转录因子等。阐明体细胞重编程过程中各分子事件间的相互联系,进而为iPS技术革新提供依据。

1.2 microRNA的改变 诱导已分化的体细胞成为多能性的干细胞(iPS)是一个复杂的过程。最近的研究发现microRNAs在维持干细胞的多能性发挥了重要的作用, 破坏microRNA会导致胚胎干细胞分化异常以及精原干细胞在体内的缺失。研究发现，小鼠和人的胚胎干细胞拥有一套特异的microRNAs，它们定位在染色体上成一簇，并与Oct4,Sox2和Nanog有相互作用，提示这些microRNAs参与维持胚胎干细胞的多 2

能性。因此我们推测microRNAs在iPS的诱导和维持中也有重要作用，是全面解析iPS诱导分子机制不可缺少的一部分. 我们将进行以下的研究：1，用Lentiviral病毒载体来诱导表达Oct4，Sox2，Nanog，Lin-28，建立可重复的iPS诱导系统,分析和发现general microRNAs和胚胎干细胞特异的microRNAs被激活的时间图谱；2，然后选择在不同时间激活的胚胎干细胞特异的microRNAs与Oct4，Sox2，Nanog共转染分化细胞,分析相应的microRNA是否对iPS的诱导有促进作用；3，在前述基础上，选择有明显促iPS诱导作用的microRNA，以此为探针，寻找其在调控多能性干细胞的信号传导和表现修饰的靶点以及调控机制。

1.3 iPS中的信号通路 iPS细胞是通过在成体细胞中转入四个因子（即转录因子）实现的。除了表观遗传学修饰改变以外，转入的转录因子必然引起相应的基因转录激活等一系列事件。因此我们将对iPS细胞在基因表达水平上进行广谱性的研究，了解体细胞重编程过程中有哪些基因表达发生显著改变；这些显著改变的基因具有怎样的时序表达规律；这些显著改变的基因之间可能形成哪些关键的调控网络，它们决定着重编程的全过程以及细胞的命运。我们将1. 分析体细胞、iPS以及胚胎干细胞（ESC）的基因表达差异，确定显著性上调的和下调的基因；2. 分析体细胞在重编程过程中不同时间的基因表达变化，确定每一天显著性上调和下调的基因，从而明确基因表达在整体水平上的时序性；3. 根据以上结果分析确定的基因，分别按重编程过程中细胞改变最显著的5个方面，即细胞周期，能量代谢，染色质DNA甲基化，组蛋白修饰以及细胞黏附分子，进行聚类，获得在以上5个方面基因表达变化最为显著的亚群，根据文献中的已知基因功能信息，初步确定可能的基因表达调控网络；4. 利用定量PCR结合过表达或shRNA下调目的基因表达，验证以上分析结果中的基因表达变化和调控网络模型。此外，我们将关注人类iPS细胞形成过程中，维持hESCs全能性及自更新至关重要的Activin，FGF信号通路的表达改变情况：其表达变化是否被Oct4，Nanog，Sox2和Lin28等外源基因调控；其表达改变是否对iPS细胞的形成所必需。在人类iPS细胞系形成之后，Activin，FGF信号对其正常维持及扩增是否起关键作用。研究Activin，FGF信号是否能促进人类iPS细胞的形成，并尝试在人类iPS细胞形成过程中使 3

用Activin，FGF等生长因子替代部分的转录因子。 在理解信号传导通路的同时，我们还将探索化学小分子作为诱导者的可能性。既然有可能通过转入四个因子改变细胞的表型，那么这四个因子所涉及的信号通路必然有化学小分子可以激活。我们已经注意到，在人类成熟体细胞转化为iPS细胞的突破性研究中，美国研究小组所用的4个基因（Oct4, Nanog, Sox2, Lin28）中有2个与日本小组（Oct4, Sox2, c-myc, klf4）的不同。据此我们推测，成熟体细胞的重编程存在多个信号途径，这些不同信号通路间很可能会有协同作用。我们最近的研究发现，Oct4, Nanog, Sox2, Lin28, c-myc与klf4一起，能够非常显著地提高成熟体细胞向iPS细胞转化的效率，诱导效率比oct4, Sox2, Lin28和 Nanog诱导高8倍（人）及10倍（小鼠），而且6个因子诱导后克隆形成的起始时间也比4个因子早2天左右。这一发现不仅证实了我们的推测，更为本项目研究iPS细胞信号转导机制研究奠定了坚实的基础。我们将从4个和6个因子诱导iPS过程中表观遗传修饰的不同变化着手，结合生物信息学分析，逐步研究和发掘iPS形成的表观遗传机制和涉及的关键细胞信号转导通路，并研究这些细胞信号转导通路的小分子抑制剂和激动剂对iPS形成的作用，最终发现提高iPS诱导效率的策略。这样的研究有望解决iPS诱导中使用大量病毒和外源基因可能带来肿瘤形成等副作用，有重要的科学技术价值和前景。

2．以其他类型细胞为出发点，诱导其成为多能干细胞，改进以及优化iPS诱导分化为神经、心肌、血液以及肝细胞的诱导方案 研究诱导体细胞成为神经、心肌、肝细胞和造血细胞等特化细胞的方案 最近的iPS细胞概念的出现，说明了只要通过少数基因的操作，就可以启动本来已经处于分化状态的体细胞的重编程，使之返回到相当于ES细胞的分化程度，并使其又重新具有了ES细胞的基本生物学特性。这一进展的发生，无疑为临床上个性化干细胞治疗的研究提供了一个全新的思路。本课题将基于iPS细胞的基本原理，进行皮肤成纤维细胞向神经肝、造血和心肌等成体细胞的诱导分化，并将通过对其调控机制的研究找到可启动皮肤成纤维细胞重编程的关键因子，进而建立可以产生源于皮肤成纤维细胞的诱导型成体细胞的技术体系，为各种疾病的细胞治疗准备条件。 我们将建立iPS的技术平台，诱导iPS逐步向造血细胞分化，在此基础上系 4

统筛选体细胞诱导为iPS的过程中以及iPS向血细胞分化过程中由于表观遗传学修饰而沉默或者表达激活的基因；进一步获得其中具有重要功能的基因，并在明确这些基因功能的基础上深入阐明其作用机制。与此同时，对iPS与ES细胞向血细胞的诱导分化过程中的表观遗传学调控机制进行比较分析。此课题有望获得在iPS重编程以及iPS向血细胞分化的过程中的受表观遗传学调控的重要功能基因，有助于人们探索iPS的调控机制。 我们将从肝损伤小鼠模型中和已有的数据库中筛选可启动皮肤成纤维细胞的肝向编程的候选相关因子，建立皮肤成纤维细胞肝向诱导体系；分析诱导型肝干细胞基本生物学特性；并研究皮肤成纤维细胞肝向转化的重编程机制。 我们已经建立了人胚胎干细胞向肝脏细胞、胰腺细胞定向分化的有效体系，并建立了分化过程中不同分化阶段的报告体系。我们计划利用我们已有的胚胎干细胞定向向胰腺及肝脏细胞分化的技术平台，分选胰腺和肝脏分化不同阶段的细胞为靶细胞，比较不同分化阶段细胞的四因子重编程效率，并利用分化过程中不同分化阶段的报告体系，寻找靶细胞形成IPS细胞过程中早期的重编程分子标志，并以此为基础研究调控重编程起始的关键因子，从而进一步优化诱导iPS形成的策略。 与此相类似的，我们还将采用我们已经建立的诱导胚胎干细胞向神经和心脏分化的体系，诱导iPS细胞定向分化，并且在疾病动物模型中研究源于iPS细胞的分化细胞移植到体内的功能。 5

二、预期目标 总体目标： 在阐明iPS细胞重编程的分子机制上有突破性进展。阐明四个因子如何在激活全能性基因的同时抑制体细胞中的组织特异性基因表达，使体细胞重新获得干细胞的特性。找出在这一细胞被重编程（即去分化）过程中起关键作用的未知因子及其分子机理。从表观遗传学修饰、microRNA表达、广谱性基因表达和信号转导等不同层面上研究iPS细胞与ES细胞和核移植ES细胞的差别，阐明iPS细胞重编程的分子机制；在此基础上探索以化学小分子诱导iPS的可能性；以iPS 细胞为起点建立和优化诱导分化为神经、血液以及肝细胞的方案并研究iPS细胞植入体内的安全性；探索以非病毒的途径和从其他细胞建立iPS的可能性；探索建立iPS细胞临床储备的可能性，全面推动iPS走向临床应用。发展壮大从事iPS研究的队伍。

五年预期目标： 1、为了阐明iPS细胞重编程的分子机制，我们将从表观遗传修饰、microRNA表

达，由四个转录因子所引发的广谱性的基因表达水平上、以及与全能性有关的信号传导通路上，通过将 iPS和ES细胞、尤其是和核移植ES进行比较，通过利用多种细胞来产生iPS，从而了解iPS中细胞重编程进程中的重要分子事件。 2、 预期该课题结题时有多于60篇的研究论文发表在高水平的国际学术刊物上，其中影响因子大于5的20-40篇，影响因子大于10的10-20篇；申请专利5-10项。 3、 培养博士后10-15人，博士研究生30-50人名，培养和壮大国内干细胞及iPS的研究队伍。