毕赤酵母诱导表达实验步骤(1)

Pichia酵母表达系统使用心得摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。

本文搜集多位用户对Pichia的使用心得和注意事项，值得一看。

生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点--使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点--酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。

近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。

越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。

P.pastoris能根据细胞生长环境(碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫)来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。

但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶( cell-bound proteases)和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。

胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。

胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。

根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶(vacuolar proteases)，细胞基质蛋白酶体(the cytosolic proteosome)以及分泌途径的蛋白酶(proteases located along the secretory pathway)。

表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathwayEn zyme Type Gene Zymoge n formVacuole PrA Aspartic PEP4YesPrB Seri ne PRB1YesCpY Serine PRC1YesCpS Metallo-( Zn 2+)CPS1UnknownApl Metallo-( Zn 2+)LAP4YesApCo Metallo-(Co2+)DAP2NoDPAP-B Seri ne SEC11 UnknownSecretory pathway sig nal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 YesKex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown ‘predict noYeast aspartyl protease iAspartic YAP3 Unknown ‘predict yes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80%的蛋白在液泡中降解。

毕赤酵母表达常用溶液及相关培养基的配制.毕赤酵母表达常用溶液及相关培养基的配制一、各种母液的配制10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基4℃保存。

34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵+100g硫酸铵,溶于1000ml水中,过滤除菌。

500*B(0.02%生物素Biotin4℃保存保存期为1年。

20mg的生物素溶于100ml水中,过滤除菌。

100*H(0.4%Histidine组氨酸4℃保存保存期为1年。

400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,(加热至50℃以促进溶解,过滤除菌。

10*D(20%Dextrose葡萄糖保存期为1年。

200g葡萄糖溶于1000ml水中,过滤除菌。

10*M(5%Methanol甲醇保存期为2个月。

将5ml的甲醇与95ml水混匀,过滤除菌。

10*GY(10%Glycerol甘油保存期为1年以上。

将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。

100*AA(0.5%of each Amino Acid,各种氨基酸4℃保存,保存期为1年。

分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌。

1M磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH6.0,将1mol/L 的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀,其pH为6.0,若需调节pH,用磷酸和氢氧化钾调节。

二.毕赤酵母表达的培养基配制2.1LB(Luria-Bertani培养基:Trypton l%Yeast Extract0.5%NaCl l%(pH7.0制作平板时加入2%琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存。

用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin25ug/ml。

2.2LLB(Low Salt LB培养基:Trypton l%Yeast Extract0.5%NaCl0.5%(pH7.0制作平板时加入2%琼脂粉。

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蛋白 ｇ４ 单链抗体 （ｉ ｌ Ｃ ａ ｖ ｒ ｍ ｎ， ｃｖ 为靶 向， ｐ１ Ｓ ｇ ｈｉ Ｆ ａ ｅｔ ＳＦ ） ｎｅ ｎ ｆｇ 构了重组蛋白， 运用制备的感染靶细胞模型进行检测 ， 结果显示 了该制剂具有很好的
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收稿 日期 ： ０ ６１ － ． ２０ —１０ ６
基 金 项 目 ： 林 省科 学技 术 厅 科 研 基 金 （ 准 号 ： ０６ ５ ０ 资 助 ． 吉 批 ２ ００ ７ ）
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Ｖｏ ． １２８
２ ０ ０ ７ 年 ８月
高 等 学 校 化 学 学 报
ＣＨＥＭＩ ＣＡＬ Ｊ ＯＵＲＮ ＡＬ ＯＦ ＣＨＩ Ｓ ＵＮＩ ＲＳ ＥＳ ＮＥ Ｅ ＶＥ ｍ
Ｎｏ ８ ．
１９ ４ ３～１ ９ ４ ６
新 型 抗 ＨＩ １重 组 导 向 制 剂 Ｓ ４ Ｖ・ Ｌ１ 在 毕 赤酵 母 中的表 达 及 活 性 实验