免疫组化染色的常见问题及定量分析课件

免疫组化结果 分析和判断
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第一节 免疫组化结果的判断原则 免疫组化结果的判断原则概括起来有 以下几点：
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⒈必须同时设对照染色。没有对照染 色的免疫组化染色结果是不可信的。
⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应 定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内； PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应 定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部 位的阳性着色，一概不能视为阳性。
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假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组 织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果 ，谓之假阴性。其原因与组织处理不当， 组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、 错加、失效、变质等),操作失误等有关。
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对照结果判断：
▪ 阳性对 ▪ 阴性对
照
照
▪
1▪ （ －）
▪
（－）
▪
2▪ （ ＋）
▪
（＋）
▪
3▪ （ ＋）
▪
（＋）
▪
4▪ （ －）
▪
（－）
▪
5▪ （ ＋）
▪
（－）
▪
6▪ （ ＋）
▪
（－）
▪
7▪ （ ＋）
▪
（－）
▪ 替代对 ▪ 检测结果 照
▪ 结果判断
▪ （－） ▪ （－） ▪ 抗体失活，操作有误
▪ （＋） ▪ （＋） ▪ 非特异性染色
▪ （－） ▪ (＋)(－) ▪ 阴性对照内含定位抗原
▪ （－） ▪ （＋） ▪ 阳性对照不含定位抗原
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这类阴性试剂对照的选用原则是： ①空白对照不能省，其他对照在预实验 中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂 ；②对照必需与实验片同步进行染色； ③对照的结果应附合要求。
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可能原因
解决办法
通透作用破坏了膜
去除缓冲液中的通透剂
固定的方法对抗原不合适
尝试不同的固定剂，关于固定剂的使用选择见补充材料
没有及时固定引起抗原扩散
取材后立即固定
可能原因
解决办法
缺乏抗原
做Western blot检测目标蛋白是否有表达或原位杂交检测mRNA是否有表达
抗体无效
避免反复冻融；用阳性片子进行检测
抗原修复无效
改进抗原修复方法
抗原-抗体结合不足
加大一抗浓度，增加孵育时间
抗体不能穿过细胞
加Triton x-100到封闭液中，通透组织
2，高背景
下图样本是小鼠皮下移植瘤组织，目标蛋白LYVE1，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，与A图相比，B图背景高。
可能原因
解决办法
脱蜡不足
适当延长二甲苯浸泡次数和时间
干片，组织过于干燥
避免干片
抗原修复过度
减少修复时间
内源性酶干扰
添加淬灭操作
Fc受体干扰
用二抗来源的血清取代BSA封闭
抗体浓度过高
适当增加稀释比例
染色时间过长
镜检观察显色，合膜组织，目标蛋白IL-10，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，在与A图相同位置的B图中没有检测到抗原，反而在组织边缘检测到组织表达。
下图样本是人小肠粘膜组织目标蛋白il10a图是我们想得到的结果b图是做出来的实验结果在与a图相同位置的b图中没有检测到抗原反而在组织边缘检测到组织表达
免疫组化实验常见问题及解决方案
1，缺乏染色
下图样本是正常人肝血管组织，目标蛋白是α-平滑机动蛋白，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，与A图相比，在红圈处并没有检测到抗原。

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多抗和单抗的比较
均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好
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主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异

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加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅 度地提高，其机理推测可能是加热打开 了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗 原决定簇的交联，但机理目前仍然还不 是十分清楚。
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4.抗原修复液的选择

加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液 （pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前 首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背 景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修 复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同 时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
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1、微波修复
本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效， 主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后， 会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴 露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短 时间应用。在 0.01M PH6.0 柠檬酸缓冲液 微波 修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟， 不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。
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胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓
度 及 消 化 时 间 易 控 制 ， 常 用 0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃ 可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5 左右，消化 20~30′ 或更长，消化后切片应充 分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化， 破坏组织结构

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2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
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哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
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比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
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这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。