免疫组化技术常见问题及处理方法ppt课件
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免疫组化技术-PPT课件
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理：
组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体；
浓缩型。
减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
对照： 阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。 阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 c-erbB-2
免疫组化
A细胞 B细胞
D细胞
上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。
前列腺特异性抗原（PSA）：
甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ， 370C ， 30min；
同一部位呈不同程度显 无分布规律，某一片均匀着 色 色
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理：
组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体；
浓缩型。
减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
对照： 阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。 阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 c-erbB-2
免疫组化
A细胞 B细胞
D细胞
上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。
前列腺特异性抗原（PSA）：
甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ， 370C ， 30min；
同一部位呈不同程度显 无分布规律，某一片均匀着 色 色
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组织化学技术-PPT精选文档
3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在 荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发 光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中 某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光 技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊 断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶 的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于 光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
4、被检测的物质
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、 多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病 原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA的异同
1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗 原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品 内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能 更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通 过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量 ，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组 化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原 结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。 与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首 选方法之一。
免疫组化技术ppt课件
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗 体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋 巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合 杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体 是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从 动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
《免疫组化技术》课件
特点
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化技术常见问题及处理方法
详细描述
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
04
仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
THANK YOU
感谢聆听
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
04
仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
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感谢聆听
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
contents
目录
• 实验操作问题 • 染色问题 • 仪器设备问题 • 图像分析问题 • 质量控制与标准化问题
01 实验操作问题
抗原修复问题
总结词
抗原修复是免疫组化实验中的关键步骤，处理不当可能导致抗原失活，影响染色结果。
详细描述
抗原修复过程中需注意使用适当的修复液和修复条件，如pH值、温度和时间，以保持 抗原的完整性和活性。修复液的选择和使用方法需根据抗原类型和抗体特异性进行选择
感谢您的观看
背景染色过高
可能是由于抗体非特异性结合或 清洗不彻底造成，可通过增加清 洗次数或使用低浓度的抗体解决。
组织切片染色不均
可能是由于切片厚度、组织处理 不当或抗体分布不均导致，需确 保切片质量并优化组织处理流程。
室间质评问题
不同实验室间染色结果差异大
可能是由于抗体来源、实验操作、仪器设备等不同造成，需建立统一的操作规程和质控标准。
04 图像分析问题
图像分析软件选择问题
总结词
选择合适的图像分析软件是进行免疫组化图像分析的 关键，不同的软件具有不同的特点和适用范围。
详细描述
在选择软件时，需要考虑软件的算法、功能、操作简 便性、准确性以及是否符合实验室需求等因素。常用 的免疫组化图像分析软件包括Image Pro Plus、 ImageJ、CellProfiler等。
总结词
背景染色问题通常是由于非特异性结合或内源性酶的干扰导致的。
详细描述
为减少背景染色，可以尝试增加洗涤次数，以减少非特异性结合；同时，使用内源性酶抑制剂可以有效抑制内源 性酶的干扰。此外，优化抗体稀释比例和使用低速离心技术也可以帮助减少背景染色问题。
contents
目录
• 实验操作问题 • 染色问题 • 仪器设备问题 • 图像分析问题 • 质量控制与标准化问题
01 实验操作问题
抗原修复问题
总结词
抗原修复是免疫组化实验中的关键步骤，处理不当可能导致抗原失活，影响染色结果。
详细描述
抗原修复过程中需注意使用适当的修复液和修复条件，如pH值、温度和时间，以保持 抗原的完整性和活性。修复液的选择和使用方法需根据抗原类型和抗体特异性进行选择
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背景染色过高
可能是由于抗体非特异性结合或 清洗不彻底造成，可通过增加清 洗次数或使用低浓度的抗体解决。
组织切片染色不均
可能是由于切片厚度、组织处理 不当或抗体分布不均导致，需确 保切片质量并优化组织处理流程。
室间质评问题
不同实验室间染色结果差异大
可能是由于抗体来源、实验操作、仪器设备等不同造成，需建立统一的操作规程和质控标准。
04 图像分析问题
图像分析软件选择问题
总结词
选择合适的图像分析软件是进行免疫组化图像分析的 关键，不同的软件具有不同的特点和适用范围。
详细描述
在选择软件时，需要考虑软件的算法、功能、操作简 便性、准确性以及是否符合实验室需求等因素。常用 的免疫组化图像分析软件包括Image Pro Plus、 ImageJ、CellProfiler等。
总结词
背景染色问题通常是由于非特异性结合或内源性酶的干扰导致的。
详细描述
为减少背景染色，可以尝试增加洗涤次数，以减少非特异性结合；同时，使用内源性酶抑制剂可以有效抑制内源 性酶的干扰。此外，优化抗体稀释比例和使用低速离心技术也可以帮助减少背景染色问题。
免疫组化结果判断及常见问题的分析ppt课件
40
析
“阴阳脸”着 色
免疫组化结果判断及常见问题的分
41
析
气泡
免疫组化结果判断及常见问题的分
42
析
非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
免疫组化结果判断及常见问题的分
23
析
2、图象处理系统组成
图象输入（显微镜、扫描仪） 图象处理运算（病理图文分析软件） 图象、数据输出
免疫组化结果判断及常见问题的分
24
析
3、图象处理系统功能
几何形态学定量分析 细胞核、浆的大小、面积、核浆比； 细胞分布密度、个数； 血管、 腺体的面积、密度；间质的面积 免疫组织化学分析 按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量 DNA倍体分析 计算正常细胞及肿瘤细胞DNA 含量，给出倍体参数、DNA参数分布 直方图 AgNOR分析 颗粒分析：数目、大小、面积、比例
免疫组化结果判断 及常见问题分析
武汉大学病理学教研室 杨飞
免疫组化结果判断及常见问题的分
1
析
免疫组化结果判断及常见问题的分
2
析
肝脏：CK8理想着色，胆管上皮细胞强阳性， 肝细胞呈不同层次阳性。
免疫组化结果判断及常见问题的分
3
析
pan CK（AE1/AE3） 在肝脏理想的染色，采用了热修复。 肝细胞膜、胆管强而清晰的着色。背景干净。
免疫组化结果判断及常见问题的分
25
析
免疫组化结果判断及常见问题的分
26
免疫组化结果判断及常见问题的分析49页PPT
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
免疫组化结果判断及常见问题的分析
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
免疫组化技术常见问题及处理方法 ppt课件
• 切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细 胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想 • 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃） • 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
PPT课件 26
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱 短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细 胞肿胀等现象
PPT课件
27
细胞涂片的处理
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
PPT课件
28
抗原修复
• 概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中
封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复
• 原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭
部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生 交联,可能会封闭抗原决定簇
• 解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验
PPT课件
35
修复过度复过度的实验组
PPT课件
37
修复过度的对照组
PPT课件
38
修复过度的对照组
PPT课件
39
酶消化修复
PPT课件
40
缩短修复时间
PPT课件
41
热抗原修复的问题：内源性生物素
热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用 卵白素抗生物素系统会产生假阳性
应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统
PPT课件
43
热抗原修复的缓冲液
• pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品 化修复液等 • 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
PPT课件 26
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱 短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细 胞肿胀等现象
PPT课件
27
细胞涂片的处理
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
PPT课件
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抗原修复
• 概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中
封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复
• 原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭
部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生 交联,可能会封闭抗原决定簇
• 解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验
PPT课件
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修复过度复过度的实验组
PPT课件
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修复过度的对照组
PPT课件
38
修复过度的对照组
PPT课件
39
酶消化修复
PPT课件
40
缩短修复时间
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热抗原修复的问题：内源性生物素
热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用 卵白素抗生物素系统会产生假阳性
应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统
PPT课件
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热抗原修复的缓冲液
• pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品 化修复液等 • 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好
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1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
.
固定不充分
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标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组
免疫组化技术
常见问题及处理方法
.
免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
.
免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
.
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
.
.
免疫组织化学的分类
• 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
织发硬发脆 • 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷， 而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片
.
标本的切片、捞片、烤片
• 切片通常以3～4um的厚度为宜• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃）
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
.
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
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细胞涂片的处理
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可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
.
免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
.
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
.
• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，
中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
.
二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
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免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
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鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体 • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途
.
SP法
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
TBS浸洗3分钟×5次。 • 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸
洗3 分钟×5次。 • 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
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Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
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石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
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固定不充分
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标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组
免疫组化技术
常见问题及处理方法
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免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
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免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
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6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
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免疫组织化学的分类
• 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
织发硬发脆 • 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷， 而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片
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标本的切片、捞片、烤片
• 切片通常以3～4um的厚度为宜• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃）
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
.
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
.
细胞涂片的处理
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可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
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免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
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Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
.
• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，
中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
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二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
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免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
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鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体 • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途
.
SP法
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
TBS浸洗3分钟×5次。 • 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸
洗3 分钟×5次。 • 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
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Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
.
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一