GSH和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响

第３２卷第４期　２０１０年１２月　Ｖｏ１．３２ＮＯ．４　Ｄｅｃ．２Ｏ１Ｏ　

ＧＳ　Ｈ和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响　

柳　海　星　

（延边大学农学院动物科学系，吉林延吉１３３００２）　

摘要：研究活性氧（ＲＯＳ）一过氧化氢和抗氧化剂一还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）对小鼠２一细胞期胚胎体外发育的　影响．用含有不同浓度Ｈ　Ｏ。的ｍＳＯＦ液培养小鼠胚胎，从Ｈ　０。浓度０．１４　ｍｇ／Ｌ组开始的囊胚发育率显著　低于对照组和其它组（Ｐ＜Ｏ．０５）；以ｍＳＯＦ液为基础液，在添加０．１４　ｍｇ／Ｌ　ＨｚＯ　的基础上分别添加不同浓度　的ＧＳＨ，阳性对照组的囊胚发育率显著高于阴性对照组（Ｐ＜Ｏ．０５）；在添加外源性Ｈｚ０２（Ｏ．１４　ｒａｇ／Ｌ）的情况　下，随着ＧＳＨ浓度的增加其囊胚发育率也显著增加．结果表明，Ｈ。０：可诱导小鼠２一细胞期胚胎体外发育的　

阻滞，ＧＳＨ可阻止Ｈ。０ｚ对小鼠２一细胞期胚胎的抑制效果．　关键词：过氧化氢；胚胎；体外发育阻滞；谷胱甘肽　

中图分类号：￥８６５．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—７９９９（２０１０）０４—０２８１—０４　

在离体培养哺乳类（包括人）着床前早期胚胎的时候，普遍发现这样的事实：在化学组分确定的培养基　

中，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育完全过程，而停顿在某个特定的发育时期，把这种现象称　

作“发育停滞（ｂｌｏｃｋ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）”．小鼠受精卵在体外培养时，其发育常停滞于２一细胞期，此现象称为　

“２一细胞停滞（２一ｃｅｌｌ　ｂｌｏｃｋ）”［１—３．　

活性氧（ＲＯＳ）来自氧的新陈代谢，是新发现的一类信号分子，它们化学性质活泼，容易引发氧化还原反　

应．外源性ＲＯＳ的加入或细胞受刺激后ＲＯＳ的产生常常会引起细胞内某些蛋白激酶活性的变化，从而激发　

一系列磷酸化、去磷酸化反应的信号传递过程．Ｈ　ｏ２可作为各种细胞刺激和调节系统中的第二信使，如果　

其含量失控，则可能通过对类脂物和蛋白质的过度过氧化反应而危害细胞，导致发育阻断．　

体外培养期间谷胱甘肽的合成对卵母细胞及胚胎的发育有很重要的作用．ＧＳＨ属于含巯基的、小分子　

肽类物质，具有抗氧化和整合解毒作用［３］．ＧＳＨ能参与体内氧化还原过程，能和过氧化物及自由基结合，以　

对抗氧化剂对巯基的破坏，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基酶不被破坏，同时还可对抗自由基对重要　

脏器的损害，卵母细胞中ＧＳＨ浓度可作为衡量哺乳动物卵母细胞质和核成熟程度的标志，有助于早期胚胎　

发育　４・５１．　

１材料与方法　

１．１供试动物　

昆明小鼠购于延边大学医学院实验动物室，ＩＣＲ小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司．母鼠群　

养，公鼠单笼饲养，颗粒饲料，自由饮水．８：ＯＯ～２Ｏ：Ｏ０光照，２０：Ｏｏ～８：００黑暗．饲养室温度控制在　

１８￣２４℃．选用体成熟的健康的４～６周龄、２０￣３０　ｇ左右的１４７只昆明母鼠和６～８周龄的ＩＣＲ公鼠作供　

试动物．　

１．２小鼠２一细胞期胚胎的收集　

为获得更多的受精卵，一般使用ＰＭＳＧ—ＨＣＧ法进行超排处理．注射ＨＣＧ　３６～４６　ｈ后冲卵，得到２一　

细胞期胚胎．将雌鼠用颈椎脱臼法致死，打开腹腔取下输卵管，放入培养液中．　

收稿１３期：２Ｏ１Ｏ—ｌｌ一１Ｏ基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０２７０９５４）．　作者简介：柳海星（１９７９一），男（朝鲜族），

吉林梅河口人，延边大学农学院动科学系讲师　２８２　延边大学农学学报　第３２卷　

１．３胚胎的培养　

每个培养液滴约２Ｏ　Ｌ大小，放人１ｏ枚受精卵．把它们放在饱和湿度、５　ＣＯ　和９５　空气的气相条　

件，并在３７℃恒温的二氧化碳培养箱内培养．每隔２４　ｈ更换１次新鲜培养液，并观察记录胚胎的发育情况．　

１．４试验内容　

１）不同浓度的外源性ＨｚＯ　对小鼠２一细胞期胚胎体外发育的影响　注射ＨＣＧ　３６～４６　ｈ后，以昆明　

旱×ＩＣＲ舍的１　０９２枚２一细胞期胚胎为供试胚，以ｍＳＯＦ液为基础液，分别配制含Ｈ。Ｏ。浓度为０，０．１２，　

０．１３，０．１４，０．１５和＞０．１７　ｍｇ／Ｌ的ｍＳＯＦ液为不同处理组，体外培养２４　ｈ．随后将所有胚胎全部移入含　

３　ｍＭ葡萄糖的ｍＳＯＦ液中继续培养至囊胚．通过试验筛选出外源性Ｈ　Ｏ：对小鼠２一细胞期胚胎产生体外　

发育阻滞的最低浓度．　

２）不同浓度的外源性ＧＳＨ对外源性Ｈ。０２（０．１４　ｒａｇ／Ｌ）诱发小鼠２一细胞期胚胎发育阻滞的影响注　

射ＨＣＧ　３６￣４６　ｈ后，以昆明旱Ｘ　ＩＣＲ舍的５０８枚２一细胞期胚胎为供试胚，以ｍＳＯＦ液为基础液，分别配制　

无Ｈ２０２＋无ＧＳＨ组，无Ｈ２　Ｏ２＋１　ｍＭ　ＧＳＨ组，０．１４　ｍｇ／Ｌ　Ｈ２０ｚ＋１　ｍＭ　ＧＳＨ组，０．１４　ｍｇ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２＋　

２　ｍＭ　ＧＳＨ组，０．１４　ｍｇ／Ｌ　ＨｚＯｚ十５　ｍＭ　ＧＳＨ组，分别处理１２　ｈ后移入ｍＳＯＦ液中继续培养，培养４８　ｈ后　

再移入含３ｍＭ葡萄糖的ｍＳＯＦ液中继续培养至囊胚．通过试验筛选出添加外源性Ｈ　０。（Ｏ．１４　ｍｇ／Ｌ时），　

克服小鼠２一细胞期发育阻滞的最佳外源性ＧＳＨ浓度．　

１．５统计处理方法　

不同浓度的外源性Ｈ　Ｏ　对小鼠２一细胞期胚胎体外发育率的影响试验用Ｘ２检验方法进行显著性检　

验；不同浓度的外源性ＧＳＨ对外源性ＨｚＯ：（Ｏ．１４　ｒａｇ／Ｌ）诱发的小鼠２一细胞期胚胎体外发育率试验采用　

方差分析进行显著性检验．　

２结果与分析　

２．１　昆明小鼠的超数排卵结果　

对１４７只昆明小鼠进行超数排卵处理，冲卵小鼠有１１０只．在ｌ１ｏ只冲卵小鼠中共收集到３　１８０枚２一　

细胞期卵，其中有２　５４４枚形态正常的２一细胞期胚胎用做供试卵（表Ｉ）．　

表Ｉ　昆明小鼠的超数排卵结果　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　

２．２　不同浓度的Ｈ　Ｏ　对小鼠２一细胞期胚胎体外发育的影响　

表２不同浓度的Ｈ。ｏ。对小鼠２一细胞期胚胎体外发育的影响　

Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　Ｈ２　Ｏ２　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　２－ｃｅｌｌ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｉ

ｎ　ｖｉｔｒｏ　第４期　柳海星，等：ＧＳＨ和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响　２８３　

由表２可知，对照组，０．１２，０．１３，０．１４，０．１５和＞０．１７　ｍｇ／Ｌ组的囊胚发育率分别为２２．２　，１５．８　，　

１６．３　，３．３　，１．１　９／６和０．经统计分析，对照组、０．１２和０．１３　ｍｇ／Ｌ组的囊胚发育率显著高于０．１４，０．１５和　

＞０．１７　ｍｇ／Ｌ组（Ｐ＜０．０５）．　

２．３　不同浓度的ＧＳＨ对Ｈ。０　诱发的２一细胞期发育阻滞胚胎体外发育的影响　

由表３可知，无Ｈ　Ｏ　＋无ＧＳＨ组（阴性对照组）、无Ｈ　Ｏ　＋１　ｍＭ　ＧＳＨ组（阳性对照组）、０．１４　ｍｇ／Ｌ　

Ｈ２Ｏ２＋１　ｍＭ　ＧＳＨ组、０．１４　ｍｇ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２＋２　ｍＭ　ＧＳＨ组、０．１４　ｍｇ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２＋５　ｍＭ　ＧＳＨ组的囊胚发育率　

分别为１６．０　，３１．０％，１５．０　，２９．０　和４１．０　．经统计分析，无Ｈ：Ｏ。＋１　ｍＭ　ＧＳＨ组的囊胚发育率显著　

高于无Ｈ　Ｏ　＋无ＧＳＨ组（Ｐ＜０．０５）；其它３组之间均差异显著．　

表３　不同浓度的ＧＳＨ对Ｈ。Ｏ　诱发的２一细胞期发育阻滞胚胎体外发育的影晌　

Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＧＳＨ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　２－ｃｅｌｌ　ｅｍｂｒｙｏ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｌｏｃｋ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　Ｈ２ｏ２（０．１４　ｐｐｍ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　

注：阴性对照组不添加Ｈ　０。和ＧＳＨ，阳性对照组仅添加１　ｍＭ　ＧＳＨ，其它３个处理组均添加０．１４　ｍｇ／Ｌ　ＨｚＯｚ和对应浓度　

ＧＳＨ　

３讨论与结论　

１）不同浓度的Ｈ　Ｏ　对小鼠２一细胞期胚胎体外发育的影响　

试验结果表明，随着所添加外源性Ｈ　Ｏ　浓度的增高，其囊胚发育率也显著降低．因此认为发育阻滞与　

源自Ｈ　Ｏ　的有害自由基含量上升有一定的联系．这与Ｎａｓｒ—Ｅｓｆａｈａｎｉ等提出的ＲＯＳ能抑制正常细胞分裂　

的结论相一致．　

值得注意的是，对照组的囊胚发育率（２２．２　）低于其它两个对照组的囊胚发育率（５３．９　、３１．０　），这　

很可能是因为对照组胚胎在体外培养２４　ｈ之后（４一细胞期胚胎）放人含３　ｍＭ葡萄糖的ｍＳＯＦ液中培养至　

囊胚的，而试验２的对照组胚胎都是在体外培养４８　ｈ之后（８—１６细胞期胚胎）放入含３　ｍＭ葡萄糖的　

ｍＳＯＦ液中培养至囊胚的．有资料显示，小鼠胚胎在８一细胞前不能利用葡萄糖，但可将其合成糖原．糖原的　

异常积累导致胚胎细胞内部的生化反应发生障碍，影响其它酶系的完善和正常功能，抑制重要基因的转录，　

从而引发发育受阻．　

２）不同浓度的ＧＳＨ对Ｈ　Ｏ　诱发的小鼠２一细胞期胚胎体外发育阻滞的影响　

还原型ＧＳＨ在保持细胞循环和保护细胞不受活性氧类的破坏方面也起到重要作用，一般被认为是一　

种重要的细胞保护成分之一［６　］．有人发现还原型ＧＳＨ在维持细胞的氧化还原状态和保护细胞免受具有氧　

化类物质的伤害中起着非常重要的作用＿８　］．卵母细胞保护它们自已就是通过大量堆积还原型ＧＳＨ，直到完　

成受精过程．外源性ＧＳＨ对小鼠、牛和水牛胚胎的体外发育也具有促进作用ｎ　“］．　

该实验也得到相似的结果，添；０Ｈ＃Ｉ－源性Ｈ：Ｏ　（Ｏ．１４　ｍｇ／Ｌ）的情况下，随着外源性ＧＳＨ含量的增加，其　

囊胚发育率也增加．但也有一些研究结果表示，培养液中添加外源性抗氧化剂ＧＳＨ时，对胚胎的体外发育　

没有促进作用［１　，因此，有待于进一步研究．

　２８４　延边大学农学学报　第３２卷　

参考文献：　

［１］Ｍｉｙｏｓｈｉ　Ｋ，Ａｂｅｙｄｅｅｒａ　Ｌ　Ｒ，Ｏｋｕｄａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ　ａｎｄ　Ｍｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　ｉｎ　ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｃｅｒｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒａｔ　Ｏｎｅ－ｃｅｌｌ　Ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｆｅｒｔ，１９９５，１０３（１）：２７—３２．　［２］Ｇａｒｄｎｅｒ　Ｄ　Ｋ，Ｌａｎｅ　Ｍ．Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｒｅｇｕｌａｔｅ　Ｍｏｕｓｅ　ｏｖａ　ｆｒｏｍ　Ｔｗｏ—ｃｅｌｌ　ｔｏ　Ｂｌａｓｔｏｅｙｓｔ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ，　

１９９３，４８（２）：３７７—３８５．　［３］Ｓｍｉｔｈ　Ｃ　Ｖ，Ｊｏｎｅｓ　Ｄ　Ｐ，Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ　Ｔ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｔｈｉｏｎｅ：ｉｍｍｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９６，１４０：１—１２．　［４］Ｍｉｙａｍｕｒａ　Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｍ，Ｈａｍａｎｏ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ｏｏ