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硫酸软骨素生产新工艺研究

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文章编号:10069798(2003)04005504硫酸软骨素生产新工艺研究󰀁

高󰀁华,刘󰀁坤,于兹东,刘克为(青岛大学医学院,山东青岛266021)

摘要:为建立一种硫酸软骨素生产的新工艺,以牛鼻软骨为原料,采用增大碱浓度提取、复合酶水解及浓缩后酒精沉淀的方法探讨了工艺条件。在最佳实验条件下,得到硫酸软骨素为白色粉末,其纯度达95.2%,收率为32.6%。这一工艺可有效提高产品纯度和收率,值得推广应用。关键词:硫酸软骨素;软骨;制备中图分类号:Q539󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁硫酸软骨素(chondroitinsulfate,简称CS)是一种天然酸性黏多糖,属生物高分子化合物。CS有A、C和D3种异构体,均是由D葡萄糖醛酸和N乙酰D氨基半乳糖组成,只是硫酸基位置不同。CS广泛存在于人和一些动物如猪、牛、羊、鱼等软骨组织中,且通过共价键与核心蛋白相结合。CS具有促进冠状动脉循环、降血脂、抗凝血、抗肿瘤和防止血管硬化等活性[13],主要是治疗风湿和类风湿疾病的药物,对冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞等心血管疾病的防治有一定疗效。CS已成为国外流行的保健品添加剂。目前国内生产企业普遍采用稀碱提取和胰酶水解的生产工艺,生产周期较长,成本较高,CS收率和质量经常波动,难于满足生产需要。为此,本文研究了一种硫酸软骨素生产新工艺,可有效提高硫酸软骨素的收率和纯度。1󰀁材料和方法1.1󰀁材料仪器:UV260紫外分光光度计(日本岛津公司);AVATAR360型红外光谱仪(美国尼高力公司);PHS2精密酸度计(上海雷磁仪器厂);ZFQ85A旋转蒸发器(上海医用专机厂);CY420恒温水浴箱(北京长安科学器材厂);SHBB88循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DHG9076A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备责任有限公司)。试剂:硫酸软骨素A,美国Sigma公司产品;氢氧化钠、盐酸、乙醇、双氧水、丙酮、溴化钾均为分析纯(上海化学试剂公司);复合酶制剂(青岛大学医学院药学系自制)。原料:牛鼻软骨(青岛信隆生化制品有限公司提供)。1.2󰀁方法1.2.1󰀁工艺流程软骨󰀁预处理󰀁碱提取󰀁酶水解󰀁热处理󰀁脱色󰀁浓缩󰀁沉淀精制󰀁干燥󰀁CS产品1.2.2󰀁操作要点1)预处理󰀁取软骨置于恒温蒸锅中80󰀁煮5h,捞起用自来水洗净,去除肌肉和油脂、绞碎,称重。2)碱提取󰀁软骨与NaOH(1mol/L)溶液按1󰀁2的质量比加入NaOH,控温45󰀁搅拌提取2h,然后用4mol/LHCl调节pH=6~7,用双层滤布过滤,滤液待用。3)酶水解󰀁在上述滤液中加4mol/LNaOH调节pH=8.5~9.0,按料液与复合蛋白酶1000󰀁1的质量

󰀁收稿日期:20030708基金项目:山东省教育厅资助项目(J00C59)作者简介:高华(1963),男,硕士,教授,现主要从事精细化工和医学化学的教学及科研工作。第18卷第4期2003年12月青󰀁岛󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITYVol.18No.4Dec.2003比加入蛋白酶,控温40~50󰀁水解4h。在水解过程中应不断调节溶液pH=8.5~9.0,水解完全程度可取少许水解液滴加50g/L三氯醋酸,观察溶液混浊程度确定。4)热处理󰀁将水解液80󰀁加热30min,加入4mol/LHCl调pH=3,静止2h后过滤。5)脱色󰀁在上述滤液中加入4mol/LNaOH调pH=10.5,按滤液与双氧水200󰀁1的质量比加入双氧水,氧化脱色6h后过滤,滤液加入4mol/LHCl调pH=7。6)浓缩󰀁将滤液温度控制在50~60󰀁真空浓缩至原体积的百分之一,待沉淀。7)沉淀精制󰀁不断搅拌下加入酒精至65%沉淀,搅拌后静置6h过滤,滤饼加水溶解再加入酒精至85%沉淀,过滤,滤饼用95%酒精或丙酮脱水1次,抽干。8)干燥󰀁将上述沉淀置于恒温干燥箱中,控温60󰀁干燥4h得高纯度产品。1.2.3󰀁纯度鉴定采用红外光谱仪对硫酸软骨素标准品和样品进行检测确定硫酸软骨素纯度,KBr压片法。1.2.4󰀁成分分析硫酸软骨素含量测定:间苯三酚分光光度法[4];氮含量测定:半微量凯氏定氮法[5];水份测定:常压干燥法[6];澄清度测定:用分光光度法测定640nm处50g/L溶液的吸光度值。2󰀁结果与讨论2.1󰀁产品质量指标表1󰀁硫酸软骨素质量指标测定结果项󰀁目标准指标测定结果性状白色粉末白色粉末CS含量󰀁90%95.2澄清度(A640nm)󰀁0.050.02水份󰀁10%7.8%pH值5.5~7.56.5蛋白质(TCA)合格合格氮含量(干品计)3.1~3.33.19硫酸软骨素产品主要质量指标测定结果见表1所示。由表1可见,新工艺制备硫酸软骨素产品各项质量指标完全符合标准要求。2.2󰀁产品纯度硫酸软骨素标准品(Sigma)和样品的红外光谱图,如图1和图2所示。2红外光谱图相似,均在3400cm-1(󰀁OH,存在多糖羟基),1620cm-1(C=O,存在羰基),1560cm-1(C󰀁N,存在乙酰氨基),1240cm-1及860cm-1(存在硫酸基)有特征吸收峰;在1800~2800cm-1的一段宽带上2图有差异,硫酸软骨素标准品(Sigma)谱图从1800cm-1起逐渐向左上倾斜,这是由于标准品中主要含有硫酸软骨素C造成的,而硫酸软骨素样品谱图较平中段略凹,说明样品中主要含有硫酸软骨素A[7]。由此可说明,新工艺生产硫酸软骨素产品纯度较高,且

主要是硫酸软骨素C。56青󰀁岛󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报第18卷󰀁2.3󰀁产品收率根据上述工艺,所获产品主要为CSNa,每千克牛鼻软骨干原料可获326g产品,产品收率达32.6%,产品纯度为95.2%。2.4󰀁工艺条件硫酸软骨素为酸性黏多糖在软骨组织中以蛋白多糖形式存在,已知蛋白多糖中硫酸软骨素多糖链与核心蛋白通过共价键连接(糖肽键),而蛋白多糖的聚集体则通过次级键(氢键和盐键等)形成。可见,从软骨组织中提取硫酸软骨素仅依靠破坏次级键的方法是不够的,而必须以降解蛋白质的方法,破坏多糖链与蛋白的共价结合方能达到提取软骨素的目的。为此,本研究采用碱提取和酶水解的工艺技术实现硫酸软骨素的有效提取。碱提取过程是提高硫酸软骨素收率的关键。碱提取以往技术采用稀碱温和条件下制备的样品溶液混浊,且时间长,污染严重,其原因在于该条件下软骨中的胶原蛋白、粘蛋白等不能完全水解,而且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的,在溶液中不易被除去。经乙醇沉淀所制得的产品含变性蛋白,一旦溶于水后就出现混浊,产品中小分子杂质如多肽等也随同聚合物沉淀,影响产品纯度。本研究碱提取工艺采用1mol/LNaOH较大浓度提取,能有效释放硫酸软骨素,同时使部分蛋白质降解及变性沉淀,缩短了提取时间,避免了杂质的沉出,保证了硫酸软骨素较高的提取率和产品纯度。碱提取的最佳条件是按料液质量比1󰀁2加入1mol/LNaOH溶液,温度控制在45󰀁,搅拌提取2h。酶水解过程是提高硫酸软骨素产品纯度的关键,通过酶解处理使可溶性蛋白进一步得到水解破坏。酶解过程应适当控制酶用量、酶解时间、酶解温度和酶解过程pH值等条件,以提高蛋白质水解效率。酶解过程中应注意严格控制溶液pH值,因为随着水解的进行及氨基酸释放,反应液pH值不断下降,注意用NaOH调节并控制pH值8以上。本研究采用自制复合酶能有效水解蛋白质,同时又能抑制酶解过程中硫酸软骨素的破坏,其适宜条件为:按复合蛋白酶与料液1󰀁1000的质量比加入蛋白酶,控温40~50󰀁,保持溶液pH=8.5~9.0,水解4h。本研究对碱提取和酶解后溶液,采用先低温真空浓缩,再酒精沉淀的处理工艺,使溶液硫酸软骨素浓度提高,硫酸软骨素沉淀更加完全,同时减少了沉淀硫酸软骨素需要的酒精量,达到了提高产品收率和降低生产成本的目的。3󰀁结论本研究所建立的硫酸软骨素生产新工艺,采用增大碱浓度提取,自制复合酶制剂酶解,以及先浓缩后酒精沉淀等技术工艺条件,从而提高了产品纯度和收率,降低了生产成本。在最佳实验条件下,得到硫酸软骨素为白色粉末,产品纯度达95.2%,收率为32.6%。参考文献:[1]󰀁TimarJ,DiczhaziC,BarthaI,etal.Modulationofheparansulfate/chondroitinsulfateratiobyglycosaminoglycanbiosythesisinhibitoraffectslivermetabolicpotenyialoftumorcells[J].IntJCancer,1995,62(6):755763.[2]󰀁MouranoPAS,PereiraMS,PavaoMSG,etal.Structureandanticogulantactivityoffucosylstedchondroitinsulfatefromechinoderm[J].JBiolChem,1996,271(39):2397323979.[3]󰀁张天民,吴悟桐,王发同,等.动物生化制药学[M].北京:人民卫生出版社,1981.215223.[4]󰀁高华,刘坤,于兹东,等.间苯三酚分光光度法测定硫酸软骨素的研究[J].中国生化药物杂志,2000,21(5):247248.[5]󰀁卫生部药政局,中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药出版社,1996.263265.[6]󰀁宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998.518519,572583.[7]󰀁MathewsMB.Isomericchondroitinsulfate[J].Nature,1958,181:421424.57󰀁第4期高󰀁华,等:硫酸软骨素生产新工艺研究NEWMETHODFORPRODUCTIONOFCHONDROITINSULFATE

GAOHua,LIUKun,YUZ-idong,LIUKe-wei(CollegeofMedicalScience,QingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Abstract:Toresearchanewmethodforproductionofchondroitinsulfate,thetechnologicconditionsofextrac-tionchondroitinsulfatefromanimalcartilagesuchasbovinenosecartilagewasstudied,withtheextractionpro-cessofincreasingconcentrationofstrongbases,theenzymehydrolysisprocessofcompoundenzymeandthealco-holprecipitationmethodaftervacuumevaporation.Underthebestextractionconditions,thewhitepowderofchondroitinsulfatewasobtainedattheyieldrateof32.6%andthepurityof95.2%.Usingthemethod,thechondroitinsulfatecanbeeasilygottenathighyieldandgoodquality.Keywords:chondroitinsulfate;cartilage;preparation58青󰀁岛󰀁大󰀁学󰀁学󰀁报第18卷󰀁

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硫酸软骨素的提取工艺研究

硫酸软骨素的提取工艺研究

硫酸软骨素的提取工艺研究

郑志新; 孙丰梅; 石光雨

【期刊名称】《《河北北方学院学报（自然科学版）》》

【年(卷),期】2008(024)003

【摘 要】目的以羊的气管为原料,采用稀碱-浓盐工艺法提取,确定最佳的工艺条件.方法用20%的NaCl浓盐浸提,期间用NaOH不断调节pH值.结果在40℃提取,90℃盐解,酒精浓度为70%时,产品质量合格.将第一次沉淀物重新溶解后再沉淀,解决了澄清度不合格的问题.结论从羊的软骨中提取CS的平均收率是7.6%,含量为84.9%,澄清度0.018,氮含量2.97%,粉末洁白.

【总页数】4页(P37-40)

【作 者】郑志新; 孙丰梅; 石光雨

【作者单位】河北省张家口市动物卫生监督所 河北 张家口 075000; 河北北方学院动物科技学院 河北 张家口 075000; 河北北方学院党委宣传部 河北 张家口

075000

【正文语种】中 文

【中图分类】O652.7

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硫酸软骨素

硫酸软骨素

1 硫酸软骨素的提取和纯化工艺及其应用展望

张蒙蒙 09生物工程（2）班

摘要

日前，由科技部会同国家发改委、财政部、教育部、中科院、中国工程院、自然基金会、中国科协等有关部门和单位，共同编制完成的《国家“十二五”科学与技术发展规划》正式发布。其中，生物医药卫生领域的相关工作在规划中占重要地位。在生物医药领域，各种动物源性的活性物质被大量利用以治疗各种困扰人类的疾病，如蟾蜍提取物、全蝎提取物、蜈蚣提取物及蛇胆提取物等。本文就从动物软骨中提取的硫酸软骨素的生产工艺、分析方法及临床应用的新进展予以简单的描述，介绍了硫酸软骨素的来源、结构、性质及其生理功能，对硫酸软骨素的提取方法——中性盐法、 碱提取法、 酶提取法、 超声波法﹑乙酸抽提法和纯化方法——溶剂法、季铵盐化合物沉淀法、超滤膜法、色谱法电泳法的具体工艺路线及其优缺点进行了综述。

关键词：硫酸软骨素；提取；纯化；生产工艺；分析方法；临床应用

一、前言

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)是一种酸性粘多糖，广泛存在于哺乳动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中。硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的双糖聚合物，它通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在，当其水解时发生消去反应，连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的苷键断裂，可以得到游离态的硫酸软骨素。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末,具有吸湿性，易溶于水而成粘度较大的溶液，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落,在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病，与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化性溃疡，与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质，其保湿性能比甘油卓越，添加了硫酸软骨素的化妆品统称价格也较贵。

软骨素提取方案汇总

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软骨素提取方案汇总

硫酸软骨素提取 方案一：

稀碱-酶解提取法 软骨煮沸 4-6h（ 80℃） 与 2% NaOH 混匀（ 1：

6.25） 提取 1.5h调 滤液 pH（ HCl， 6-6.5） 过滤 滤渣与

2%NaOH 混匀（ 1:0.12） 提取 1h 合并滤液调 pH（ 8.0-9.0） 加入胰酶（ 1 000:0.5） 水解 1h加入胰酶（ 1000:0.5） 水解 1.5h加高岭土和活性炭吸附（ 用硅藻土代替） 氯仿萃取取水层调

pH6.8-7.295%乙醇沉淀（ 2.5 倍） 软骨素 步骤：

先将软骨在 80℃水中煮 4～ 6h， 然后按原料（ 干质量） 与

2%氢氧化钠的比例为 1∶6.25 的量加入氢氧化钠溶液， 室温提取

1.5h，然后用盐酸调 pH 到 6～ 6.5， 双层纱布过滤； 留下滤液，

滤渣再以1∶0.12 的质量比加入 2%的氢氧化钠溶液， 于 40℃下提取 lh， 再用双层滤布过滤； 弃滤渣， 取滤液。

合并 2 次滤液， 并测量体积待用。

滤液调节 pH 到 8.0～ 9.0， 按滤液与胰酶 1000∶0.5 的比例加入胰酶，于 40～ 50℃水解 lh 后，再按 1000∶0.5 的质量比加入胃蛋白酶，40～50℃水解 1.5 h， 过滤后加入高岭土和活性炭吸附。

用氯仿反萃取法萃取滤液， 留水层。 调水层 pH 至 6.8～ 7.2， 再加入 2.5 倍体积的95%以上乙醇沉淀， 即得硫酸软骨索。

硫酸软骨素的制备及应用

硫酸软骨素的制备及应用

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硫酸软骨素的制备及应用

作者：罗曦

来源：《健康科学》2019年第01期

摘要：硫酸软骨素是从动物软骨中提取的黏多糖类物质，在防治心血管疾病、关节病等方面具有重要作用。随着硫酸软骨素的新功能、新用途不断扩大，应用范围也逐渐扩展，除了作为药品外，大量的硫酸软骨素是作为改善关节病的补充产品。在国际市场强劲的需求拉动下，我国硫酸软骨素产业迅速发展壮大。本文通过对国内外硫酸软骨素相关文献的综述总结，从其结构、来源、理化性质、制备及应用等方面详细介绍了硫酸软骨素的功能性质，为硫酸软骨素作为功能因子在保健食品方面的应用提供了支持。

关键词：硫酸软骨素；酶解；发酵；应用

1.来源

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，ChS）是在哺乳动物中发现的生物材料，特别是在动物腿骨、软骨、皮肤、神经组织和血管中较为丰富。中国药典2010版中ChS主要有三个来源，即猪的喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织；此外还有海洋动物的软骨，牛、鸟类及人类食用家禽类的软骨等。除此之外，最近的研究通过生化方法和核磁共振图谱鉴定出巴西蟾蜍的毒液中也存在ChS，其可能对于蛋白质含量起保护作用。最近也有研究发现，比起常规的酶提取法，利用鸡的腿骨熬汤来提取ChS更为方便，而且，基于中国食品工业的传统的烹饪骨汤，这也为联合生产骨汤和ChS提供了新的思路。

2.硫酸软骨素的制备工艺

作为我国一种重要的出口原料药，硫酸软骨素有着多种生产工艺。ChS产品的价格取决于商品中ChS的含量与纯度，从动物软骨中提取ChS的过程中可能残留的多肽、蛋白质、核酸会使ChS的价值大打折扣，因此提高产品的纯度是企业与院校一个重要的研究方向。近年来，国内ChS行业进入一个新的阶段，在生产ChS的同时回收联产蛋白成为行业主流，实现了原料的综合利用，使污染减少，效益提高。而疯牛病、禽流感等疾病的产生与流行也使人们对寻找新的原料来源（如海洋生物）和生产方法（如微生物发酵）的关注度逐步提升。