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小鼠巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉酵母相细胞的实验观察

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试验三小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬现象备课笔记

试验三小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬现象备课笔记
蚌埠医学院教师备课笔记
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导语：
我们已经知道，白细胞包括粒细胞，单核细胞和淋巴细胞三大类，而其中，粒细胞和单核细胞的吞噬活性较强，因此，这两类细胞称为吞噬细胞。血液中的单核细胞是巨噬细胞的前身，它在血液中停留1-5天以后，穿出血管进入到组织和体腔当中，分化成巨噬细胞，具有活跃的变形运动、明显的趋化性和一定的吞噬功能。
同时，巨噬细胞的吞噬实验也被用作衡量机体免疫功能的一项重要指标。比如在正常情况下，巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分率为61.39%~64.15%，而恶性肿瘤病人的吞噬百分率通常却在45%以下，同样，吞噬指数也很低。当手术切除肿瘤，或者通过放疗、化疗病情好转时，吞噬率以及吞噬指数都会回升，所以在肿瘤的疗效判断中巨噬细胞的吞噬实验是一项重要的参考指标。可以用来分析判断机体的免疫水平。
三实验器材（课堂展示）
总结以往所学导入新课
讲授
结合临床实例激发学生兴趣
蚌埠医学院教师备课笔记
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四实验步骤
1．实验前1天小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝），诱导小鼠吞噬细胞渗出。
2．小鼠腹腔注射1％的鸡红细胞悬液1ml，轻揉腹部使鸡细胞分散。
3．20min后，将小白鼠颈椎脱臼处死。
（2）不同吞噬阶段的巨噬细胞形态：慢慢移动载玻片，在视野中还可以发现处于吞噬过程不同阶段的各类巨噬细胞和鸡红细胞。有的巨噬细胞已经将1至数个红细胞部分吞入；将不同吞噬阶段的巨噬细胞形态动态的连贯起来，就能够绘制出吞噬作用的全过程。有的巨噬细胞已经吞入了1个或者几个红细胞并在细胞质中刚刚形成椭圆形的吞噬泡；有的巨噬细胞内的吞噬细胞体积缩小，并呈现出圆形，这是与初级溶酶体发生融合，泡内物正在被消化分解。

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定,实验报告（共2篇）

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定,实验报告（共2篇）

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定,实验报告(共2篇)实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程；2. 了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法二、实验原理吞噬作用也称为胞吞作用（cellular eating），指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质（直径一般大于250mm）的过程。

许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。

不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。

吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。

内吞内吞体吞噬溶酶体胞吐巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。

吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。

吞噬百分率＝吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数三、实验材料、试剂及器材（一）材料：1. 健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL。

2. 抗凝鸡血（二）试剂:1. 4%淀粉肉汤2. D-Hanks液3. 0.85％生理盐水4. 180IU/mL肝素钠生理盐水溶液（三）用品普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等四、实验操作1. 巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带(转载于: 写论文网:)针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。

实验十一小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察『目的要求』1

实验十一小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察『目的要求』1

捉拿方法：
将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持 其尾巴向后拉，小鼠那么会尽力向前蹬。 用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤， 然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。
腹腔注射
给药方法：
小白鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静 脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们 常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如 前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用 酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下， 进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹 腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿 左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的 液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。
『实验原理』 高等动物体内存在着具有防疫功能的吞
噬细胞系统，它由粒细胞和单核细胞等白细 胞构成，是机体免疫系统的重要组成局部。 巨噬细胞是体内的一种重要的免疫细胞，具 有非特异性吞噬功能，当机体受到细菌等病 原体及其它异物侵入时，巨噬细胞将向病原 体或异物游走，当接触异物时，伸出伪足将 其包围并进行内吞作用，将病原体或异物吞 入细胞，形成吞噬泡，进而初级溶酶体与吞 噬泡发生融合，将异物消化分解掉。本实验 将观察到小鼠巨噬细胞对进入其体内的鸡血 红细胞进行吞噬的情况。
单核巨噬细胞
『实验内容和方法』 (一)标本制备 1、在实验前一天，每只小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤(含4％
的台盼蓝)lml。 2、实验时每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％的
鸡红细胞悬液lml。然后轻揉小鼠腹部，使鸡红细胞分 散。(腹腔注射时不要刺伤内脏) 3、20分钟后向腹腔注射0.5 ml生理盐水，轻揉小鼠腹部， 使其腹腔液稀释。3分钟后用用颈椎脱臼法处死小鼠。 4、将小鼠置于解剖盘中或卫生纸上，剪开腹腔，把内脏 推向一侧，用吸管或不装针头的注射器吸取腹腔液。 5、每人取一干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片， 标本便制备好了。 6、实验绘图。

小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌实验的改良法

小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌实验的改良法

作者:孙明洁，高燕，赵冬，王珂, 靖学芳【摘要】目的探讨一种简便易行的小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌实验的改良法。

方法在巨噬细胞吞噬鸡红细胞和巨噬细胞吞噬酵母菌实验基础上建立一种新的吞噬实验方法。

结果实验组吞噬10min的结果吞噬百分率57％，吞噬20min的结果吞噬百分率86％，吞噬30min的结果吞噬百分率63％。

结论结果显示小鼠巨噬细胞吞噬酵母菌20min的吞噬百分率可高达86％，说明这种改良法简单而有效。

【关键词】小鼠巨噬细胞；酵母菌；吞噬酵母菌实验改良法 The mice macrophage swallows the saccharomycetes experimental improvement method 【Abstract】 Objective Discusses one kind of simple macrophage to swallow the saccharomycetes method. Methods Swallows the chicken red blood cell by the macrophage and the macrophage swallows the saccharomycetes in the foundation newly to establish one kind to swallow experimental method. Results Experimental group，the phagocyte swallows saccharomycetes 10 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 57%. The phagocyte swallows saccharomycetes 20 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 86% . The phagocyte swallows saccharomycetes 30 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 63%. Conclusion The result showed the mice macrophage swallows saccharomycetes 20 minutes after to swallow the percentage to be possible to reach as high as 86%，simply explains this kind of improvement method but to be effective. 【Key words】mice macrophage；saccharomycete；swallows the saccharomycetes experimental improvement method 巨噬细胞对颗粒性抗原具有很强的吞噬功能，可用鸡红细胞、酵母菌等作为吞噬颗粒来观察其吞噬效果。

实验一 巨噬细胞吞噬功能实验

实验一 巨噬细胞吞噬功能实验

实验一巨噬细胞吞噬功能实验1、【实验原理】(1)巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。

能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。

MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。

(2)此实验采用体内法，即：在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡红细胞30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美蓝染色，油镜下计数吞噬鸡红细胞的百分数，及观察巨噬细胞中内因被杀死而染为蓝色的鸡红细胞的形态、数目，以判断巨噬细胞中的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。

2、【实验步骤】（1）试验前3d，小白鼠腹腔注射6％无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。

（2）实验时，每只小鼠腹腔注射鸡红细胞液1ml，轻揉腹部，使红细胞在腹腔中分布均匀，利于吞噬（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用吸管取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.03％冷美蓝溶液，盖上盖玻片。

（4）低倍镜下找到观察区域后，换高倍镜下进行观察，计数3、【实验结果】4、【结果分析】（1）如图所示，在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可以看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。

（2）镜下可见吞噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。

(3)由于未将腹腔液和冷美蓝溶液充分混合均匀，使得视野中出现大片深染区域。

总体实验结果较好，视野中央可见清晰的吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞。

5、【注意事项】（1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。

（2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。

（3）如小鼠腹腔液过少，可注入适量生理盐水。

（4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。

（5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。

实验二双向琼脂扩散实验1、【实验原理】（1）可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀线/环的现象，称为沉淀反应。

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验

2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果在 37C 条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解， 也就不能计数为吞噬了菌的细胞。
3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的 吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞 数就相应的少一点。
血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有 两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图）， 每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此， 每大方格容积为0.1mm3。
计数时，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上 线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。 计数应重复3次，取其平均值。
数完毕后，依下式计算： 每1mL白细胞悬液细胞数＝（4个中方格细胞总数 /4） ×104× 稀释倍数
每1mL红细胞悬液细胞数＝（80个小方格细胞总数 /80） ×400×104× 稀释倍数
（2）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平皿 培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水 配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清， 再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用 生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
（3）吞噬细胞与菌混合培养 取巨噬细胞0.5ml加白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡5分钟。 剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一
小口(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于 试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清， 沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞用含10％小 牛血清1640配成适当浓度备用(1-2×106／ml)。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验

巨噬细胞_实验报告分析(3篇)

第1篇一、实验目的本次实验旨在了解巨噬细胞的基本生物学特性，包括其来源、分化、功能及其在免疫应答中的作用。

通过实验观察巨噬细胞的形态学变化、吞噬功能以及细胞因子分泌等，进一步了解巨噬细胞在免疫应答中的重要作用。

二、实验原理巨噬细胞是免疫系统中的关键细胞，起源于骨髓中的单核细胞，在血液中分化为成熟的巨噬细胞。

巨噬细胞具有广泛的生物学功能，包括吞噬、抗原呈递、分泌细胞因子等。

在免疫应答中，巨噬细胞可以识别并吞噬病原体、凋亡细胞等异物，将其降解成抗原肽，并呈递给T细胞，激活特异性免疫应答。

三、实验方法1. 巨噬细胞培养：取小鼠骨髓细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，每隔3天更换培养基，培养至第7天收集细胞。

2. 巨噬细胞吞噬实验：将培养的巨噬细胞与鸡红细胞混合，在37℃、5%CO2条件下培养2小时，观察吞噬情况。

3. 巨噬细胞细胞因子分泌实验：将培养的巨噬细胞与LPS（脂多糖）或PHA（植物血凝素）刺激，检测细胞因子（如TNF-α、IL-6）的分泌。

4. 巨噬细胞形态学观察：使用光学显微镜观察巨噬细胞的形态学变化，如细胞大小、形态、细胞器等。

四、实验结果与分析1. 巨噬细胞培养：在培养过程中，巨噬细胞呈圆形、椭圆形或多角形，细胞质丰富，细胞核较大，呈圆形或椭圆形。

2. 巨噬细胞吞噬实验：观察结果显示，巨噬细胞可以吞噬鸡红细胞，吞噬百分率约为60%。

3. 巨噬细胞细胞因子分泌实验：在LPS或PHA刺激下，巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-6水平显著升高，表明巨噬细胞在免疫应答中发挥重要作用。

4. 巨噬细胞形态学观察：巨噬细胞在吞噬鸡红细胞后，细胞体积增大，细胞质丰富，细胞器增多，表明巨噬细胞在吞噬过程中发生了形态学变化。

1. 巨噬细胞在体外培养过程中可以分化为成熟的巨噬细胞，具有吞噬和分泌细胞因子的功能。

2. 巨噬细胞在免疫应答中发挥重要作用，可以识别并吞噬病原体、凋亡细胞等异物，并激活特异性免疫应答。

小吞噬实验 - 辽宁医学院基础医学实验教学中心

小吞噬实验 - 辽宁医学院基础医学实验教学中心
实验内容
➢ 一、中性粒细胞吞噬功能测定 ➢ 二、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
实验原理 实验材料 实验方法 观察结果
➢ 【原理】
利用注入腹腔的淀粉肉汤液作为刺激物，使 Mφ向腹腔移行，再将CRBC注入小鼠腹腔 而被Mφ吞噬。
【结果观察】
胞浆呈淡紫色， 胞核与细菌呈紫 蓝色。
注意事项
v 用后的玻片一定要放到玻片缸内!! v 接种环使用前后要烧灼灭菌 v 采血量不能太少 v 小鼠、酒精棉和采血针仍到撮子里 v 托复染5min， 水洗，吸干后镜检。
【结果观察】
胞浆呈淡紫色， 胞核呈紫蓝色，一 个Mφ可吞噬多个 CRBC，有的Mφ 胞内遗留CRBC被 消化的痕迹。
中性粒细胞吞噬功能测定
实验原理 实验材料 实验方法 观察结果
➢ 【原理
中性粒细胞具有非特异性吞噬功能，将 细菌与中性粒细胞混合孵育，可促使中性粒 细胞吞噬细菌，清除外来异物。
➢ 【材料】 1. 2.载玻片、采血针、接种环、G-W染液。
【方法】
1. 2.用采血针采耳血一大滴，用载玻片一角取下与菌液混
合(载玻片要先用酒精消毒)。 3.将载玻片放入湿盒37℃孵育25—30min 4.用接种环取表层菌血混合液涂片，干燥，用G-W染色
液，初染1min，蒸馏水复染5min，水洗，吸干后镜 检。
➢ 【材料】
1.健康小鼠、2%淀粉肉汤液、生理盐水、 5%CRBC。
2.注射器、载玻片。
【方法】
v 1.实验前两天，给小鼠腹腔注射灭菌的2%淀粉肉汤 液1ml
v 2. 5% CRBC 1ml腹腔注射，轻揉腹部，使CRBC 散开，30min后脱颈处死小鼠，剖开腹腔，用毛细 吸管吸出腹腔渗出液后滴加在载玻片 ，涂片，自然 干燥。

lab-5小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察

（3）将腹腔细胞悬液滴于干净玻片上，置 37 ℃ 湿盒内。 1～2h后倾去玻片上的液体。并用腹腔冲洗液轻洗玻片， 即可见玻片上有毛玻璃样的单层核巨噬细胞粘附，巨噬 细胞含量可达9ห้องสมุดไป่ตู้%。
（4）在显微镜下计算巨噬细胞的百分比，以检测分离结果。
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五 注意事项
（1）皮肤和腹膜要分别剪开，并确保皮肤血液 不流入腹腔。
（2）腹腔内的冲洗液要全部吸干。 （3）腹腔冲洗液洗玻片时要适量，既要保证将
盐分清洗干净，又不将细胞洗脱。
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六 思考题
绘图并描述观察到的各种细胞的形态特征 计算腹腔巨噬细胞的百分比。
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MΦ分布：单核细胞主要于血液中，巨噬细胞几乎存在 于所有表皮和黏膜下组织。
MΦ形态：有伪足，马蹄状单核，细胞形体大。
MΦ分离纯化：小鼠和大鼠腹腔内有丰富的巨噬细胞， 可用腹腔清洗的方法获得较多细胞悬液。正常小鼠每 只可收集腹腔渗出细胞106，其中30%为巨噬细胞，如 果给小鼠腹腔注射某中刺激物，可使巨噬细胞渗出增 加，易于分离更多的巨噬细胞。
纯化：巨噬细胞易于沉降和贴壁，对X射线不敏感，而 淋巴细胞和成纤维细胞对X射线敏感。
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三 材料与器材（略）
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四 操作步骤
（1）将小鼠以颈椎脱臼法处死，仰卧，固定四肢。
（2）依次用碘酒及酒棉球消毒腹部，以镊子提取腹壁，剪 去一小块皮肤，继以镊子提取腹腔。剪一小口。以注射 器注入少量冲洗液。用滴管吸出，再注入冲洗液并吸出， 滴管在腹腔内各个位置吸取液体，冲洗每只小鼠腹腔约 共 5 mL
实验5 小鼠腹腔巨噬细胞收集 及形态观察

细胞生物学实验5巨噬细胞吞噬现象的观察

实验5 巨噬细胞吞噬现象的观察〔实验目的〕1、通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及意义2、掌握小鼠腹腔注射给药和脊柱脱臼处死的方法〔实验原理〕巨噬细胞由骨髓干细胞分化而来，然后进入血液到达各组织，并进一步分化成为巨噬细胞。

当病原体或其他异物进入机体时，能招引巨噬细胞。

巨噬细胞具有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动向异物或病原体移行，在接触到病原体或异物时即伸出伪足，将之包围并吞入胞内，形成吞噬泡，既而细胞中的溶酶体与吞噬泡融合，形成吞噬溶酶体，通过水解酶的作用将病原体杀死消化，最后将不能消化的残留物排除细胞外。

〔试剂材料〕1、器材：解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、吸管、吸水纸2、试剂：（1）0.85%生理盐水（2）Alverse溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠（NaC6H5O7.2H2O）0.89g, 柠檬酸（C6H6O7. H2O）0.05g, 氯化钠0.42g，蒸馏水100ml。

pH值调至7.2，过滤或高压灭菌，4℃保存（3）4%台盼蓝染液：台盼蓝粉末0.4g，0.85%生理盐水100ml，4.6%淀粉肉汤（牛肉膏0.3g，蛋白胨 1.0g，氯化钠0.5g，蒸馏水100ml，加热后加入可溶性淀粉6g，使其溶解，煮沸灭菌，4℃保存。

用时加热融化，加入适量台盼蓝染液）3、材料：（1）小白鼠（2）1%鸡红细胞〔内容方法〕一、腹腔巨噬细胞的吞噬1、实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝，起标记作用）1ml以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞。

2、实验时，每组取一只上述处理的小鼠，腹腔注射1%鸡血悬液0.5~1ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。

3、20分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹部，向腹腔部注射0.5~1ml生理盐水，用吸管轻轻使生理盐水与腹腔液混匀。

4、用吸管抽取腹腔液，涂片，自然干燥。

5、甲醛固定10min。

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中国真菌学杂志 2010 年 12月 第 5卷 第 6 期
ห้องสมุดไป่ตู้
Ch in J M yco,l D ecem ber 2010 , V ol 5, N o . 6
333
马尔尼菲青霉 ( P en icillium m arneff ei ) 是一 种双相型致病真菌 , 37∀ 培养或在组织体内时呈酵 母相 , 25∀ 室温培养时为菌丝相 , 感染人体可引起 高致死率的马尔尼菲青霉病。该病目前被认为是 东南亚地区的流行病, 常发生于免疫受损的人群 , 尤其是人类免疫 缺陷病毒感染者 。目前马尔 尼菲青霉与人类感染发病的关系仍不十分明了, 推 测人类通过吸入空气中的马尔尼菲青霉分生孢子 [ 3] 而致病, 并经血行播散至全身脏器 。目前尚未明 确马尔尼菲青霉酵母相细胞如何逃避巨噬细胞的 清除。本文利用小鼠腹腔巨噬细胞与马尔尼菲青 霉酵母相细胞进行体内和体外共培养, 通过马尔尼 菲青霉酵母细胞菌落形成单位 ( co lo ny for m ing u n i, t CFU )数的变化, 观察巨噬细胞对酵母相细胞的 影响。 1 材料与方法 1 . 1 实验材料 实验动物 6~ 8 周 BALB / c 小鼠由中山大学 医学院动物中心提供, 体重 20~ 25 g , 雌性。 菌株来源 马尔尼菲青霉 SUM S0152 株, 由中 山大学附属二院医学真菌研究中心提供, 分离自 1 名血液病患儿的血液标本, 经形态学和 DNA 测序 鉴定。 主要试剂和仪器 脑心浸汁培养基, 沙氏培养 基, 无菌磷酸缓冲液 ( 1 # PBS ), 钙荧光白 ( S igm a 公司 ) , DMEM 细胞培养基和细胞培养瓶 ( G ibco 公 司 ), CO2培养箱 ( H eraeus BB16 , 德国 ) , 倒置光学 显微镜 ( O lym pus CX 40 , 日本 ), 倒置荧光显微镜 ( O lym pus , 日本 ) , 超净工作台 ( 苏净 BH C 1300∃ A /B3 , 苏州安泰空气技术有限公司 ) 。 1 . 2 实验方法 酵母相菌液制备 将在脑心浸汁培养基平皿 上转种好的酵母相菌落接种于脑心浸汁液体培养 基中 , 37∀ 150 r /m in 振荡培养 72 h , 镜下观察有纯 化酵母细胞出现, 离心收集。将收集到的酵母细胞 用灭菌双蒸水洗涤 3 次 , 去除培养液, 使用 1 # PBS 6 调整菌液浓度为 1 . 5 # 10 /mL, 4∀ 保存备用。 小鼠巨噬细胞的制备 取 20~ 25 g 健康雌性 BALB / c 小鼠 3 只, 颈椎脱臼处死, 消毒小鼠腹部皮 肤, 持镊提起腹中部皮肤并剪开, 暴露腹膜 , 避开血 管分别腹腔注射无菌 1 # PBS 5 mL, 反复轻揉腹壁 5 m in后 , 无菌注射器分别取腹腔液 3~ 4 mL, 2 000
Phagocytosis of Pen ic illium marneffe i in yeast phase by m acrophages of m ice
FENG P e i y ing1, 2 , HUANG H ua i q iu2, ZHANG Jing1, 2, ZHANG X iao hu 2 i , SUN Jiu feng1, X IE Zhi1, LU Sha1, LU Chang m ing1, X I L i yan1 (1 . D ep artm en t of D er m atology and V enereo logy, the S econd Aff iliated H osp ital of Sun Yat sen Un ivers ity, Guangzhou 510120, Ch ina; 2. D ep artm en t of D erm ato logy and V ener eology, the T hird A ff iliated H osp ital of Sun Yat sen U niver sity, Guangzhou 510630, Ch ina ) Ab strac t ! O be jective T o study the effect of per itoneal m acrophag es of BALB / c m ice on phagocytos is ofP enicillium marneff ei
6
mL 于无菌离心试管内 , 37 ∀ 、 5% CO2恒温培养箱 中贴附 30 m in , 用无 菌 1 # PBS 冲洗 未被吞 噬的 酵母细胞 , 再用冰冷 的无菌三蒸水 使巨噬细胞细 胞膜破裂 , 释放出巨噬细胞内的酵母细胞 , 取菌悬 液进行菌落计数。 CFU 的测定 取 50 L 菌悬液采用梯度稀释 法, 在沙氏培养平皿上 25∀ 培养 48 h , 计菌落数 , 并以稀释倍数校正。 钙荧光白染色
in yeast phase . M ethod s Y east phaseP. m arneffei and per itonea lm acrophages o f BALB /c m ice w ere cu ltured bo th in v itro and in vivo . T he num ber o f co lony for m ing unit ( CFU ) w as counted at 60 m in, 120 m in, 240 m in and 360 m in respectively . T he d iffe rence of the CFU numbers betw een the in v itro and in vivo groupsw as then ana ly zed . Calcofluor w hite sta in w as applied to observe the m or pho logy of yeast ce lls . Resu lts CFU numbers in fou r ti m e po ints in each g roup d iffe red s ignificantly ( P < 0. 05), w hile the d iffer ence of CFU num bers betw een the in vitro and in vivo groups sho w ed no sign ificance ( P > 0. 05 ). P. marneff ei in y east phase sho w ed light blue by ca lco fluo r wh ite sta in under fluo rescence m icroscope . Conclusions N o obv ious destroy or lysis ex ists in P. m arneffei when co cultured w ith m acrophages . Ca lco fluo r w hite sta in is pre ferred for iden tification of m acrophage and yeast ce lls . K ey words! m acrophage ; P en icillium m arneff ei; co lony for m ing un it ; ca lco fluo r wh ite sta in [ Ch in JM yco,l 2010 , 5( 6): 332 335]
6
将马尔
6
尼菲青霉酵母相细胞按每瓶 1 mL ( 1 . 5 # 10 /mL ) 接种于上述含 6. 0 # 10 /mL 巨噬细胞的培养瓶中, 每个时间点培养 3 份, 放入 37∀ 、 5 % CO2恒温培养 箱, 分别作用 60 m in、 120 m in 、 240 m in 、 360 m in 取 出, 用无菌 1 # PBS 冲洗培养瓶 , 去除巨噬细胞 外 的酵母相细胞 , 用冰冷的无菌三蒸水使巨噬细胞细 胞膜破裂 , 释放出巨噬细胞内的酵母相细胞 , 取菌 悬液进行菌落计数。 酵母相细 胞与巨 噬细胞 体内共 培养
[ 1, 2]
r/m in 离心 10 m in, 弃 上清, 加入 DMEM 培 养液调 整细胞浓度 至 6 . 0 # 10 /m L, 细 胞悬液 置入培 养
6
瓶, 37∀ 培 养、 5 % CO2 恒温培养 箱 2 h 后 , 吸弃 上 清, 用预 热 培 养液 洗 2 次 , 留 下 贴 壁 细胞 , 加 入 DMEM 培养液孵育细胞。 酵母相细胞与巨噬细胞体外共培养
332
中国真菌学杂志 2010年 12月 第 5卷 第 6 期
Ch in J M yco,l D ecem ber 2010 , V ol 5, N o . 6
论著
小鼠巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉酵母相细胞的 实验观察
冯佩英
1 , 2
黄怀球
2
张静
1, 2
张晓辉
2
孙九峰
1
谢治
1
鲁莎
1
鲁长明
1
席丽艳
1
(1 . 中山大学附属第二医院皮肤科 , 广州 510120 ; 2. 中山大学附属第三医院皮肤科, 广州 510630)
6
取 12
只小鼠腹腔注射 1 m L ( 1 . 5 # 10 /mL ) 马尔尼菲 青霉酵母相细胞悬液 , 随机各取 3 只分别 60 m in、 120 m in、 240 m in 、 360 m in 后颈椎处死小鼠 , 无菌 注射 5 mL 无菌 1 # PBS 到腹腔中 , 揉匀 5 m in 后 取腹腔液 , 调细胞浓度为 6 . 0 # 10 /mL, 分别取 1
基金项目 : 国家自然科学基金 ( 30770121 ). 作者简介 : 冯佩英, 女 ( 汉族 ), 博士 , 主治医师 . E m ai: l fengpeiying@ m edm ai.l com. cn 通讯作者 : 席丽艳, E ma i:l xi liyan @ m ed m ai. l com. cn