实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
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实验四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
姓名:mangogola
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是:蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素,而大多数蛋白质与SDS 按一定比例结合(1:1.4/g:g ),这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,而且形状为短轴相同的雪茄烟形。由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量,在特定凝胶浓度下,一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系,选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白,与样品同时电泳计算得到标准曲线,并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。
一.实验过程
1.凝胶工作液的配制
2.灌制分离胶
将制胶玻璃板清洗安装紧密后,插入制孔器,在距制孔器下端1cm 处做一标记,取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm 的dd 水,目的是使凝胶面平整,放置待其聚合凝固。 3.灌制浓缩胶
将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干,放入制孔器,用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。 4.待测样品的制备
取0.1ml 透析除盐后的样品稀释液(浓度在0.2mg/ml 左右),加入0.1ml 样品溶解液,混匀后沸水浴5min ,冷却。(沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链,便于与SDS 结合,甘油可以增加蛋白质的比重,便于沉降到加样孔底部,不易飘散) 5.加样和电泳
将电极缓冲液注入缓冲液槽,然后轻轻拔出制孔器,加样后连接电泳仪,记录每个加样孔的样品类型及上样量。浓缩胶使用50V 恒压,分离胶使用100V 恒压。
浓缩胶浓度4%,交联度2.7%
[Acr (30%):Bis (0.8%)]溶液
0.67ml dd 水
3.05ml
0.5M pH6.8 Tris-Hcl (0.4%SDS )溶液 1.25ml
TEMED (原液)
6ul
将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀,加入10%的硫
代硫酸铵0.026ml ,摇匀后灌胶。
分离胶浓度12%,交联度2.7%
[Acr (30%):Bis (0.8%)]溶液
4ml dd 水
3.44ml 1.5M pH8.8 Tris-Hcl (0.4%SDS )溶液
2.5ml TEMED (原液)
6ul
将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀,加入10%的硫代硫
酸铵0.056ml ,摇匀后灌胶。
6.染色和脱色
用取胶片将两张玻璃板撬开,取出凝胶,切去浓缩胶部分及染料前端至分离胶底端部分,并在剩余胶片的右上角切去一块作为标记。而后转入盛有染色液的大培养皿中,低速振荡染色1.5h,然后分别用高浓度和低浓度甲醇溶液脱色1.5h,最后用低浓度甲醇溶液脱色过夜至背景脱色。
二.数据记录和处理
1.标准曲线绘制
蛋白质Marker的相对迁移率如下表:
标准曲线绘制如下:
2.计算样品分子量
三.分析与讨论
1.影响蛋白质和SDS结合的因素主要有:①二硫键是否被完全还原,只有在蛋白质分子内二硫键被彻底还原的情况下,SDS才能定量结合到蛋白质分子上,并使之具有相同的构象,一般以巯基乙醇作还原剂;②溶液中SDS的总量至少比蛋白质高三倍,一般需高达10倍以上;③溶液中的离子强度应较低,最高不超过0.26,所以样品要经透析处理。
2.在凝胶电泳中影响迁移率的因素有很多,而在制胶和电泳过程中,很难每次都将各项条件控制的完全一致。因此,用SDS凝胶电泳测分子量,每次测定样品必须同时做标准曲线,而不得利用另一次电泳的标准曲线。
3.凝胶电泳所用试剂要求严格,需准确配制。
4.胰蛋白酶在pH3.0下稳定,但透析后容易自容,所以上样时应尽量多一些,大约30-40uL。
附:
1. 样品溶解液(2×)
2.脱色液
3.电极缓冲液(5×) Tris 7.57g Gly 36.03g 10%SDS 25.0mL