SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量

5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去
底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再 加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 （2）取10µl样品1溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上 样量分别为5µl 和10µl。 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下 沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
二.
实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只
•
•
有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能 定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线 性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理， 巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧 化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链 （如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用 下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时 只是它们的亚基或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用 SDS-PAGE 测定分子量。如电 荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某 些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
•
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH ， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的 SDS- 蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
授课教师：周杰
一.
实验目的
• 学习 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原
理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染 色鉴定。
二 .实验原理
• 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这
• •
种现象称为电泳。 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
二.
• 1)
实验原理
2)
3)
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 二硫键是否完全被还原
浓缩胶(5%.3ml) 0.7ml 1.5ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 0.03ml 0.03ml 4µ l
四.
实验过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的 锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5 厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次 性完成,避免产生气泡.
六.思考题
• 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 当分离胶加完后 , 需
在其上加一层水,为什么? 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
• • •
3. 实验器材
• 垂直板电泳装置 • 直流稳压电源 • 移液管
• 滤纸 • 微量注射器 • 大培养皿
各部分凝胶配制
分离胶(10%.5ml) H2O 30%Acr Buffer 10%SDS 10%Ap TEMED 2.6ml 1.7ml 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.05ml 0.05ml 5µ l
.
11.实验结果分析。
五.分析计算
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的 相对迁移率作图得标准曲线，量出未 知蛋白的迁移率即可测出其分于量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的 样品的分子量测定才具有可靠性。
四. 实验过程
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※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除 气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底 需水平.
四. 实验过程
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
三.
实验试剂和器材
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融 化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
二.
实验原理
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• 采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，
往往采取2 种以上测定方法结合使用。目前其他常用 测定相对分子量的方法有： • 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量 （有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适 宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需 2000 伏特小时） • 凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单， 样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物 活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关 系比较好，但在极端 pH 时，蛋白质有可能因变性而 偏离。）