次甲基蓝与DNA作用的共振光散射光谱研究及机理分析

第３２卷第１期　２０１０年３月　湖北大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．１　Ｍａｒ．，２０１０　

文章编号：１０００—２３７５（２０１０）０１—００８８—０５　

次甲基蓝与ＤＮＡ作用的　

共振光散射光谱研究及机理分析　

盛立娇，彭毛，周建刚，宋功武　

（湖北大学有机功能分子合成与应用教育部重点实验室，湖北武汉４３００６２）　

摘要：基于脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）在ｐＨ　３．５１～４．４９的介质中对有机染料次甲基蓝（ＭＢ）的共振光散射的　增强效应，提出了一种测定ＤＮＡ的共振光散射法，并对介质酸度、离子强度、ＤＮＡ热变性、共存物质干扰等实　验条件进行了优化．在最佳条件下绘制了工作曲线，该方法线性范围为０～１　４４０　ｎｇ・ｍＩ　～，检出限可达ｌ４．１　ｎｇ・ｍＬ～，用于合成样品中ＤＮＡ的测定，结果令人满意．通过研究红外光谱、紫外一可见吸收光谱及离子强　度的影响，初步探讨了ＭＢ与ＤＮＡ相互作用的机理，ＭＢ可能是通过静电作用等以ＤＮＡ为模板在ＤＮＡ分　子表面进行聚集和长距组装，这种聚集导致ＭＢ共振光散射信号的增强，这也是该方法的理论基础．　关键词：次甲基蓝；共振光散射技术；脱氧核糖核酸　

中图分类号：０６５７．３６；Ｑ５ｏ２　文献标志码：Ａ　

脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）是重要的生物大分子，也是遗传信息的载体和基因表达的物质基础．核酸的　

定量测定可为生物体体液中其他组分的测定及遗传疾病的诊断提供重要信息，因而成为人们关注和研　

究的重要课题．ＤＮＡ内源荧光很弱，因而直接利用其天然荧光进行研究受到限制，共振光散射法逐渐成　

为研究热点　３．　

在早期的荧光分析中，散射光常作为一种干扰源而被消除．１９９３年，Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ等使用普通的荧光　

分光光度计建立了共振光散射（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＲＩ　Ｓ）技术，研究卟啉分子在ＤＮＡ分子表　

面的组装和聚集［】］．黄承志等人在此基础上做了大量的研究工作并将其作为高灵敏方法应用于核酸的　

测定［２　］．ＲＬＳ法测定核酸主要利用具有大共轭体系的“生色团”（染料或金属螯合物）在核酸分子上的聚　

集作用或长距组装而产生强烈的共振散射，作为生色团的主要是有机小分子碱性染料，卟啉类试剂（如　

ＴＡＰＰ及其质子化产物［２］）及金属螯合阳离子（如ＣＯ（ＩＩ）－５一ＣＩ—ＰＡＤＡＢ螯合物［。　）等．目前，利用增强　

有机染料共振光散射测定核酸的报道有藏红Ｔｃ　，罗丹明ＢＥ引，耐尔蓝硫酸盐嘲，亮绿　和中性红［。　等．　

亚甲基蓝（即次甲基蓝，一种深蓝色的水溶性染料，分子结构　一，Ｎ、　

Ｎ　ｓ　（Ｕ…Ｈｓ）２Ｕ—Ｉ　测定脱氧核糖核酸［９］，但在早期研究中只是作为一种新方法提出．　笔者在文献［９］的基础上研究了次甲基蓝（ＭＢ）在偏酸性介质中　图１次甲基蓝的分子结构　

（ｐＨ　３．５１～４．４９）与ＤＮＡ作用的共振光散射光谱，对实验条件进行了详细优化，并应用红外光谱、紫外　

一可见吸收光谱等初步探讨了ＭＢ与ＤＮＡ作用的机理．　

１　实验部分　

１．１仪器与试剂ＲＦ一５４０荧光分光光度计（日本岛津）；ＵＶ一２３００紫外～可见分光光度计（美国ＰＥ公　

司）；傅立叶红外光谱仪（美国ＰＥ公司）；ｐＨＢ－４　ｐＨ计（上海雷磁仪器厂）；ＷＨ一２微型旋涡混流仪（上　

收稿日期：２００８—１２—０８　基金项目：湖北省自然科学基金（２００８ＣＤＢ０１７）和有机功能分子合成与应用教育部重点实验室（２００６一ＫＬ　００６）资助　作者简介：盛立娇（１９８６一），女，硕士生；宋功武，通信作者，Ｅｍａｉｌ：ｓｏｎｇｇｗ２００８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ

，ｃｎ　第１期　盛立娇等：次甲基蓝与ＤＮＡ作用的共振光散射光谱研究及机理分析　８９　

海沪西分析仪器厂）．　

Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）一Ｈ（３１缓冲溶液，浓度为０．１　ｔｏｏｌ・Ｌ一；脱氧核糖核酸溶液：将一定量的小牛　

胸腺ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ，华美生物工程公司）于０～４。Ｃ下缓陧溶于二次蒸馏水中，并于低温保存，操作液浓度为　

９０　ｍｇ・Ｌ一．次甲基蓝（　）储备液浓度为５．０４×１０　ｍｏｌ・Ｌ一，操作液浓度为５．０４　Ｎ　１０－４　ｔｏｏｌ・Ｌ一．用　

１　ｍｏｌ・Ｌ　的ＮａＣ１水溶液控制离子强度．所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水．　

１．２实验方法在２５　ｍＩ　比色管中依次加入０．３　ｍＬ　ＭＢ溶液，适量ＤＮＡ溶液，１．０　ｍＬ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓　

冲溶液，用二次蒸馏水稀释至１０　ｍＩ　，旋涡混合，放置５　ｍｉｎ．将溶液置于　一　处进行同步扫描，可得　

共振光散射光谱．于最大共振光散射峰３６８　ｒｉｍ处测量核酸加入前后溶液的共振光散射强度差△Ｊ　．　

２结果与讨论　

２．１　ＭＢ－ＤＮＡ体系的共振光散射ｌＲＬＳ）光谱　图２为ＭＢ－ＤＮＡ体系的共振光散射光谱（ＲＬｓ光谱）．　

结果表明，碱性染料次甲基蓝本身的ＲＬＳ信号较微弱，在加入ＤＮＡ后，其ＲＬＳ信号大大增强，在３６８、　

４７０、５５０　ｎｍ左右出现了增强的共振光散射峰，但３６８　ｎｍ处的增强信号较明显且峰形较好，本实验选择　

３６８　ｎｍ为测量波长．　

２．２条件优化　

２．２．１介质酸度的选择向海艳等［　研究了亚甲基蓝与脱氧核糖核酸在近中性范围内（ｐＨ＝５．５～７．５）的　

共振光散射光谱．而本文以　ｓ—ＨＣ１缓冲溶液调节溶液的ｐＨ值，旨在研究偏酸性范围内，次甲基蓝共振光散　

射法测定ＤＮＡ含量的各种条件及有机染料与生物大分子的作用机理．Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液的用量在１．Ｏ～１．８　

ｎ　时ＲＬＳ强度较大．因此，实验选择用１．０　ｍＩ　ｐＨ＝４．４９的Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ缓冲溶液控制介质的酸度．　

２．２．２　离子强度的影响　用１　ｍｏｌ・Ｌ　的ＮａＣ１水溶液控制离子强度，测定ＭＢ－ＤＮＡ体系的共振光　

散射强度，实验结果如图３所示．由图可知，当ＮａＣ１溶液的浓度小于０．０１　ｍｏｌ・Ｉ　时，溶液的离子强　

度对体系几乎无影响；继续增大离子强度则会导致体系ＲＬＳ强度逐渐减小．因此，在体系中应避免有高　

浓度的电解质存在，在配置缓冲溶液时，应尽量避免以电解质作为缓冲介质．离子强度的影响从一定程　

度上说明了ＭＢ与ＤＮＡ之间存在静电相互作用ｌ＿３Ｊ．　

２．２．３试剂加入顺序的影响及稳定性实验实验中试剂的加入顺序对ＲＬＳ影响不大，但当按照染料　

ＭＢ－ＤＮＡ－缓冲溶液时，体系的共振光散射强度最大．按顺序加入试剂，放置４～５　ｍｉｎ后，反应基本完　

成，体系在至少３５　ｍｉｎ内测定，结果稳定．　２．２．４　ＤＮＡ热变性的影响实验研究了热变性ＤＮＡ（将ＤＮＡ在沸水浴中加热３０　ｍｉｎ后迅速放人冰　

水浴中冷却１５　ｍｉｎ以防止其复性）和天然ＤＮＡ对体系ＲＬＳ强度的影响，结果见图４．由图可知，热变　

性ＤＮＡ的共振光散射强度增大，这是由于高温和迅速冷却使得双螺旋的ＤＮＡ解链为单链，有利于　

ＭＢ分子在ＤＮＡ表面的堆积．　

图２　ＭＢ－ＤＮＡ体系共振光散射光谱　

ＣＭＢ：１．５１２×１０　ｔｏｏｌ・Ｉ　；　

ｐＨ＝４．４９；Ｃ１　Ａ（ｍｇ・Ｉ　一　）　（１—＋４）：０．Ｏ，Ｏ．９，１．８，２．７．　图３离子强度对ＭＢ－ＤＮＡ　体系ＲＩ　Ｓ的影响　

Ｃ　：１．５１２Ｎ１０　ｔｏｏｌ・Ｉ　；　

ｐＨ一４．４９　ＣＤＮＡ：１．８　ｍｇ・Ｌ一　７Ｏ　６０　５Ｏ　至４０　｛３０　２０　１０　０　

２．２．５共存物质的干扰在０．９　ｍｇ・Ｉ

　叫ＤＮＡ存在下，考虑了多种共存物质对测定的影响，结果见　９０　湖北大学学报（自然科学版）　第３２卷　

表１．从表１可以看出，大多数生物体内存在的金属离子（如Ｃａ　＋和Ｂａ。十）和氨基酸以及糖类不干扰测　

定，说明该方法具有实际应用价值．由于Ｆｅ。＋会与ＤＮＡ发生络合反应，干扰此实验，故在实验前，应将　

其除去．ＢＳＡ对体系干扰很大，这是由于ＢＳＡ与ＭＢ产生相似反应之故．　

表１共存物质对测定ＤＮＡ的影响　

序号共存物质　存在浓度／（／￣ｇ・Ｉ　）相对误差／　序号共存物质　存在浓度／（　ｇ・Ｌ　）相对误差／　１　Ｃａ２＋　２　６８８　＋３．０　７　Ｃｕ　１　Ｏ（　）４－３．２　２　Ｃｒ３　３２　０００　—０．６　８　葡萄糖　１　５３６　４－１．３　３　Ｂａ２　卜　３　０００　＋４．２　９　ＢＳＡ　１Ｏ　＋２．２　４　Ｍｎ　４００　４－４．６　１Ｏ　Ｎｉ　１　６００　４－４．４　５　Ｆｅ３＋　２００——４．８　１ｔ　Ｌ一半胱氨酸４８０　－０．３　６　Ｂｒ一４　０００　４－０．３　

２．２．６工作曲线在上述确定的最佳反应条件下，绘制了测定ＤＮＡ的工作曲线．当ＤＮＡ的质量浓度　

为Ｏ～１　４４０　ｎｇ・ｍＬ　时，体系的共振光强度与ＤＮＡ的质量浓度呈较好的线性关系．其工作曲线的线性　

拟合方程为△，ＲＬＳ一－－２．４４２＋４９．７６５Ｃ（Ｃ：ｒａｇ／Ｌ）（ｐＨ一４．４９），相关系数为ｒ一０．９９５　３．该方法检测　

限（３盯）为１４．１　ｎｇ・ｍＬ＿。．　

２．２．７合成样品的测定根据表１中共存离子组分干扰允许量配置了３个合成样品．表２列出了合成　

样品的测定结果，证明此法重复性好，结果令人满意．　

表２合成样品中ＤＮＡ的测定　

３机理探讨　

有机分子与生物大分子相互作用的机理是研究的热点，已有人使用分子吸收和发射光谱及圆二色　

谱等方法进行研究［１０＝１１］，本文中是在应用ＲＩ　ｓ法测定ＤＮＡ含量的实验基础上，综合应用红外光谱、紫　

外一可见吸收光谱、ＲＬＳ光谱等光谱技术，并结合离子强度对体系ＲＬＳ信号的影响来初步探讨ＭＢ与　

ＤＮＡ作用的机理．　

３．１　红外光谱　红外光谱可从宏观上定性研究ＭＢ与ＤＮＡ　

的相互作用．图５为ＤＮＡ和ＭＢ－ＤＮＡ体系的红外光谱图．　

ＤＮＡ的特征吸收峰归属如下：１　０９１　ｃｍ　和１　２３８　ｃｍ～，分别　

对应于ＤＮＡ磷酸基团的对称和非对称伸缩振动；１　０１５　ｃｍ　

（一般为ｌ　００３　ｃｍ　）和１　６５２　ｃｍ一　分别对应于核糖Ｃ—Ｎ和鸟　

嘌呤，胸腺嘧啶的振动．对比１和２发现，加入ＭＢ后，ＤＮＡ的　

特征峰发生了红移，分别从ｌ　６５２　ｃｍ，ｌ　２３８　ｃｍ　和ｌ　０９１　

ｃｍ　移至１　６０２　ｃｍ，１　２１５　ｃｍ　和１　０６８　ｃｍ～，说明ＤＮＡ和　

ＭＢ发生相互作用．同时，ＤＮＡ在１　０１５　ｃｍ　处的Ｂ构型特征　

吸收峰消失，可定性说明与ＭＢ结合后ＤＮＡ的构象发生了变化．　ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒｓ／ｃｍ一　图５　ＭＢ－ＤＮＡ体系的红外光谱　（１）ＤＮＡ，（２）ＭＢ—ＤＮＡ．　

３．２　ＲＬＳ光谱除了可以应用ＲＬＳ法灵敏测定生物大分子的含量外，还能根据共振光散射光谱研究　

有机分子在核酸分子表面的长距组装．根据文献［６，１０—１１］解释，带正电荷的有机分子对核酸具有凝聚　

作用（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ），当有机分子与核酸的摩尔比较高且介质的离子强度很低时，有机分子在核酸　

分子表面进行长距组装（１ｏｎｇ　ｒａｎｇｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ），形成远程堆积结构并将诱导核酸超螺旋结构的形成，当　

光与核酸的超螺旋结构作用时便产生了光共振现象，导致共振光散射增强．因而，如果有机分子与核酸　

作用时导致强烈的ＲＬＳ信号增强，

则意味着该有机分子在核酸表面进行堆积，形成了一种核酸超螺旋