细胞冻存的原理与要求
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GB8878185555334563BT9125XW
创作者： 凤呜大王*
细胞冻存的原理与要求
1. 原理：在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能
导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、
pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向培养基中加入保护剂（甘油或
DMSO）,可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
储存在－130度以下低温中能加水冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通
过细胞最易受损的－5～0度后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护
剂为DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用
浓度范围在5～10％之间，常用10％。
2. 要求：为保护细胞最大存活率，一般采用慢冻快溶的方法。标准的冻存速度为－1～
－2度/分钟，当温度达－25度时，下降率刻增至－5～－10度/分钟到－100度时则可
迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快能影响到细胞内水分透出，太慢则促进
冰晶形成。但各种细胞对冻存速度要求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐受性大些，
骨髓干细胞－1～－3度/分钟较合适，胚胎细胞耐受性较小，总之，在一开始时下降
速度不能超过－10度/分钟。另外，用什么保护剂合适和用量多大，要依细胞而定，
初代培养用DMSO较好，一般细胞可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上
皮细胞储存在20~30%甘油中很好。原则上细胞在液氮中可储存多年，但为妥善起见，
冻存一年后 ，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。
冻存液是（DMSO10%+90%FBS）
技术总结要点
1. 冷冻速度
冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物
物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是
造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。
如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度
增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度
的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或
不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。
不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻
速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度
过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生
溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细
胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两
种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，
液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻
是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对
细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受
损。
不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同
时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说，小细胞（如
红细胞等）对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103℃/min或更高；
相反大的细胞或组织，如直径100nm以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此
外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等
多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认
为降温速率以1～5 ℃/min为最佳。
2. 冷冻保存温度
冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚
至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。
冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温
度（-196 ℃）是目前最佳冷冻保存温度。在-196 ℃时，细胞生命活动几乎停止，但
复苏后细胞结构和功能完好。应用-70～-80 ℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活
性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在0～40℃范围内保存
细胞效果不佳。
3. 复苏
复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳
的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复温速度，
这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱
得多。
复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快，持续
时间也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现，
冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤，反而是在复温过程中，复温
到-40℃或者更高的温度时，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常
规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温，也就是通常采用的快速复苏。
因此，最佳复温速率与最佳冷冻速率对保证获得最佳冻存效果同等重要。
4. 冻存保护剂
冻存保护剂（Cryoprotectant）是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常为溶液）。
细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液
中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶
的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未
结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞
膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过
细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、
甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之
前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电
解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外
渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，
在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇
和丙二醇等。
非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括
聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白
及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分
子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。
减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质
损伤。
不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组
合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复
温后要及时清除冷冻保护剂
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