核酸等温扩增技术在水产病原体快速检测中的应用庞建虎;乔龙亮;朱鹏;高威芳;章礼萍【摘要】有别于费力和费时的传统病原体检测方法,基于靶基因的分子生物学检测方法以其快速和灵敏的特点逐渐成为现代水产病原体检测的首选.在众多分子生物学检测方法中,尤以核酸等温扩增技术备受关注.本文对各种核酸等温扩增技术在水产病原体检测中的应用进行了综述,阐述了各种核酸等温扩增技术的原理,对比分析了各种核酸等温扩增技术的优劣,介绍了该技术在水产病原体检测中的应用现状,展望了该技术的发展趋势,旨在促进我国水产病原体现场快速检测技术的发展.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(047)005【总页数】11页(P530-540)【关键词】核酸等温扩增;水产病原体;快速检测【作者】庞建虎;乔龙亮;朱鹏;高威芳;章礼萍【作者单位】宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波海洋研究院,浙江宁波315832;宁波海洋研究院,浙江宁波315832;宁波海洋研究院,浙江宁波315832【正文语种】中文【中图分类】Q789近年来，我国水产养殖业蓬勃发展，养殖规模和产生的经济效益都是空前的.目前，我国水产品产量占动物性食物的1/3，处在世界首位，人均占有量高于世界平均水平[1].但随着集约化养殖方式的大规模应用，产量提高的同时也导致了病害的频繁爆发.同时，由于我国水产疫苗研究起步较晚，只有较少种类的疫苗可供使用[2].鉴于此，我国水产病害的防治主要以预防为主，快速、准确和简单的检测方法对于及时找出病原体显得尤为重要.因为只有找出真正的病原，才能对症下药，在疾病发生时尽量将损失减小到最低.然而传统的检测方法(选择性培养基和生理生化试验检测)，尽管也能检测出病原体，但费力、费时和低灵敏度等缺点使得其不适合于当前水产病原体的疫情防控.如致病性嗜水气单胞菌的国标检测方法是经过一系列的生理生化试验鉴定，其检测周期长，操作十分复杂[3].分子生物学检测方法在灵敏度、特异性和检测时间等方面都优于传统病原体检测方法.核酸扩增在分子生物学检测中是常用的手段，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是目前使用最频繁的核酸扩增技术.然而对精密温控仪器的依赖限制了其在条件较差的实验室及基层渔场的使用，尤其不适合现场快速检测.而核酸等温扩增技术不需要精密的温控循环设备,在一个特定的温度下通过添加不同性质的酶和特异性引物即可快速完成核酸的扩增，极大地降低了对设备的要求，缩短了反应时间，近年来正蓬勃发展.笔者通过对近十年来相关文献的整理发现：无论是从核酸等温扩增技术的开发上，还是其在病原体的检测应用上，大多数都是由国外研究者开展的，而国内研究者在这方面涉足较少.本文对目前常见核酸等温扩增技术的原理和优缺点等方面做了比较，并对它们在水产病原体的检测应用上做了系统的综述，希望能够帮助国内读者快速了解核酸等温扩增技术，促进该技术在水产病原体快速检测领域中的应用.1 常见的核酸等温扩增技术及比较目前常见的等温扩增技术有环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、依赖解旋酶等温扩增(helicase-dependent isothermalamplification, HDA)、依赖核酸序列等温扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、链替代等温扩增(strand displacement amplification, SDA)、交叉引物等温扩增(crossing priming amplification, CPA)、滚环等温扩增(rolling circle amplification, RCA)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)等[4].1.1 LAMPLAMP技术于2000年由日本Eiken公司发明[5].其原理是：根据目的基因的6个区域设计4条不同的引物(内引物和外引物)，通过在反应体系中添加具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、反应模板和基质等，在一定温度(60～65 ℃)下不断地进行DNA合成，从而达到目的基因快速扩增的目的，可在15～60 min实现109～1 010倍的扩增.LAMP技术具有对设备要求低、操作简单、灵敏度高和特异性强等优点.因其有着高度的特异性，因此只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断.LAMP的缺点也是比较明显，如需要设计多对引物，使得引物设计较为复杂；其次是在对常规LAMP扩增产物的检测时，需要打开盖子，容易形成气溶胶，造成假阳性[6].1.2 HDAHDA是美国的研究者在2004年发明的一种等温扩增技术，其扩增原理类似于生物体内DNA的复制.主要原理如下：首先，通过解旋酶在恒等温的条件下使得DNA双链打开，随即单链DNA结合蛋白(SSB)结合到DNA单链上，抑制单链DNA重新形成双链DNA，在体系中提供了能够与引物互补结合的单链DNA模板，在DNA聚合酶催化下进行延伸(图1).刚刚合成的双链DNA随即又进入新的循环，结果使得目的基因呈指数式增长[7].图片来源于文献[6].A：解旋酶解开DNA双链；B：引物与单链DNA结合；C：DNA 聚合酶在引物基础上延伸，两条子链扩增形成；D：新的循环开始.图1 HDA 反应原理Fig.1 The principle of HDA reaction相较于传统的PCR扩增，HDA在于加入了解旋酶和单链结合蛋白，且整个扩增过程是在一个温度条件下进行的，避免了PCR扩增过程中通过温控仪来控制反应的进行.目前，研究者通过在体系中添加逆转录酶等，HDA也已经成功应用于RNA模板的扩增[8].HDA技术原理和对设备要求均简单，只需要恒温器即可，无需复杂引物.1.3 NASBANASBA技术是在PCR扩增技术的基础上发展起来的核酸扩增技术.NASBA是在等温条件下通过3种酶来控制反应，分别是来自禽流感病毒的逆转录酶(AMV)、来自大肠杆菌的核糖核酸酶(RNaseH)和来自噬菌体的T7RNA聚合酶[9].其原理是：整个扩增过程包括非循环相和循环相.在非循环相扩增过程中，反向引物在模板RNA上扫描与之互补的序列，随之反向引物与其特异性结合，在AMV的催化作用下合成互补的cDNA链，形成了RNA-DNA杂合体.随即RNAaseH特异地将RNA-DNA杂合体中的RNA链降解掉，带有启动子序列的正向引物与单链cDNA 结合，合成双链DNA.由于新合成的双链DNA带有可以被T7RNA聚合酶特异地识别的启动子序列，由此进入循环相扩增，高效、特异地合成反义RNA(图2).由于双链DNA中T7启动子序列的加入，而外来DNA不具有这样的结构，因此，NASBA不易受到污染，使得其特异性远远高于普通PCR扩增技术[10].图片来源于文献[11].A：反向引物在RNA模板扫描与之互补的序列；B：反向引物与模板特异性结合；C：RNA-DNA杂合体形成；D：RNA-DNA杂合体中的RNA链被降解；E：带有启动子序列的正向引物与单链DNA结合；F：互补链DNA延伸，带有T7启动子序列的DNA双链形成，以此为模板合成正向RNA；M、L、G、K、H、J、I：循环相步骤.图2 NASBA反应原理Fig.2 The principleof NASBA reaction1.4 SDAWalker et al[12]于1992年开发了SDA.其主要原理是：首先，通过引物与单链DNA进行特异地识别，在具有链置换活性的聚合酶催化下合成具有HincⅡ酶识别位点的目的DNA序列，由此进行SDA循环扩增.通过HincⅡ酶切割具有识别位点的目的DNA序列，通过聚合酶在切割处对3′端进行延伸扩增，互补链则被替换；新合成的替代链作为新的模板，体系中通过循环进行这些步骤，达到目的DNA序列快速扩增的目的.SDA虽然具有扩增效率高和特异强的优点，但也有缺点，如反应成本较高，且由于产物中存在单、双链DNA产物，因此电泳时拖尾现象较明显.1.5 CPACPA由杭州优思达公司完全独立研发，是目前我国首个具有完全自主知识产权的核酸等温扩增技术[13].该技术无需预变性步骤或者通过切口酶打开双链，在恒温63 ℃下引物与模板结合成混合物，反应产物中通过自发形成的泡状结构，交叉引物与5′端的结合可激发链置换反应的进行[14].CPA技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便的优点.但该反应体系复杂、方法不稳定和假阳性现象等缺点也限制了该技术的使用[4].1.6 RCARCA技术于1998年建立的一种核酸等温扩增技术，扩增原理类似于CPA技术[15].目前主流的指数RCA的主要原理是：首先，正向引物结合到环状DNA序列上，在聚合酶作用下继续延伸，产生带有反向引物的结合位点的单链DNA，随即反向引物结合到单链DNA并进行延伸，产生的子代单链DNA充当模板，进行新的扩增(图3).扩增的结果是产生许多长短不一的双链DNA产物，扩增效率大大提高.虽然RCA技术具有高灵敏度和高效的扩增技术，但也存在着锁式探针连接效率、背景信号干扰和拓扑结构制约等问题[16].图片来源于文献[6].A：正向引物结合到环状DNA序列上并进行延伸；B：继续扩增，产生带有反向引物的结合位点的单链DNA;C：反向引物结合到单链DNA并进行延伸；D：产生的子代单链DNA充当模板，进行新的扩增.图3 指数RCA扩增原理Fig.3 The principle of hyperbranched RCA reaction1.7 RPARPA技术是被称为有望替代PCR技术的核酸扩增技术，是由英国TwistDx公司开发的核酸等温扩增产品.该技术对硬件设备的要求很低，一个简单水浴锅即可[17].它的原理是：在恒温(37～42 ℃)条件下，重组酶与引物结合形成聚合物，能够在模板链无需热变性的情况下与引物同源序列结合，通过链置换反应形成一个“D”字型环；在聚合酶催化下进行延伸，子链分离并继续延伸，对DNA序列进行指数式扩增(图4).RPA技术的关键和难点在于前期引物和探针的设计，大多数PCR引物都不适合，且目前没有专门的引物设计软件，需要研究者亲自摸索.其扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作步骤类似于普通PCR产物的检测；也可以通过将RPA 技术与横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)技术结合起来，通过试纸条检测反应产物；还可以在反应体系中加入探针，构建实时监测反应情况的实时荧光RPA.尽管核酸等温扩增技术一般只需要在恒定温度下就可以完成扩增，但各种核酸等温扩增所需要的温度不同，以及它们扩增需要的引物数量、酶的种类和扩增时间等方面各不相同，笔者通过对相关文献的阅读并结合本课题组的科研经历，在表1系统地列举了各种常见的核酸等温扩增技术所需引物数量、温度、时间及优缺点.图片来源于文献[18].A：重组酶与引物结合形成复合物，并与同源靶序列结合；B：通过链置换形成一个“D”字型环；C：聚合酶促使引物延伸；D：子链分离，并继续延伸；E：子链形成.图4 RPA反应原理Fig.4 The principle of RPA reaction 表1 常见核酸等温扩增技术的比较Table 1 Comparison of common isothermal nucleic acid amplification techniques技术引物/条温度/℃时间/min优点缺点LAMP460～6560特异性强,扩增效率高引物设计复杂HDA260～65120扩增效率高,引物设计简单需要复杂的反应体系优化过程NASBA237～4290～120检测速度快,有商业试剂盒可以使用不适用于DNA的扩增SDA437120效率高主要适用于短片段的扩增CPA46370操作简便反应体系复杂 RCA13760适合于单链DNA的扩增成本高RPA225～4220引物设计简单,特异性高对反应条件要求高2 在水产病原体快速检测上的应用现状通过对PubMed数据库中近十年来核酸等温扩增技术在水产病原体检测上应用文献的检索发现：各种核酸等温扩增技术在水产病原体检测上的应用频次差别较大；各种核酸等温扩增技术的检测限和检测时间也各不相同；在细菌、病毒和寄生虫等病原体的检测上均有应用.表2列举了各种常见核酸等温扩增技术近十年来的具体应用情况.2.1 在细菌快速检测上的应用LAMP技术广泛应用于细菌性水产病原体的检测上，在多种致病性弧菌和链球菌等的检测上都已成功应用(表2).王耀焕等[19]建立了创伤弧菌的LAMP快速检测方法，能在1 h内高效特异地检出创伤弧菌，通过将LAMP技术与LFD技术结合起来，建立了创伤弧菌的LFD-LAMP检测方法，能够快速、灵敏、特异地检测出创伤弧菌；Wang et al[20]建立了同时检测创伤弧菌和副溶血性弧菌的LAMP检测方法，其灵敏度是常规PCR的100倍，且可以在多种样品中同时检测出创伤弧菌和副溶血性弧菌；Suebsing et al[21]根据无乳链球菌和海豚链球菌的sodA基因设计引物，建立了罗非鱼链球菌病的LAMP检测方法，其灵敏度是巢穴PCR的10倍，结果可以直接通过观察颜色变化读取.表2 近十年等温扩增技术在水产病原体快速检测中的应用Table 2 The application of isothermal amplification in the rapid detection of aquatic pathogens in the past decade技术病原体检测限检测时间/min参考文献LAMP副溶血性弧菌和创伤弧菌250 fg和125 fg19[20]鳗弧菌0.40～6.42pg30[22]海豚链球菌和无乳链球菌123和114 CFU30[21]中华肝吸虫10-8ng35[23]日本血吸虫100 fg65[24]创伤弧菌3.7×102 CFU80[19]Laem-Singh virus100 fg60[25]第三类鲤科疱疹病毒10拷贝60[26]虾白斑综合征病毒24拷贝30[27]创伤弧菌1.5×102 CFU90[28]海豚链球菌100 fg60[29]中华鳖虹彩病毒20拷贝60[30]哈维氏弧菌17.2细胞60[31]溶藻弧菌3.7×102 CFU60[32]传染性脾肾坏死病毒10拷贝20[33]大菱鲆红体病虹彩病毒7拷贝60[34]虾白斑综合征病毒1 pg50[35]黑美人弧菌102 CFU60[36]虾白斑综合征病毒1×102拷贝60[37]鲁氏耶尔森氏菌1 pg60[38]鲤春病毒血症病毒10 TCID5060[39]创伤弧菌107 CFU60[40]虾白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒100 fg和10 pg60[41]虾白斑综合征病毒100拷贝60[42]弧菌103 CFU60[43]传染性皮下及造血组织坏死病毒100拷贝60[44]迟缓型爱德华氏菌10 CFU45[45]创伤弧菌100拷贝60[46]传染性皮下及造血组织坏死病毒6拷贝60[47]桃拉综合征病毒100 fg60[48]斑节对虾浓核病毒1 ng75[49]斑节对虾浓核病毒0.1 pg75[50]斑节对虾浓核病毒50拷贝60[51]溶藻弧菌1×102 CFU30[52]传染性脾肾坏死病毒1 fg45[53]隐性死亡病毒6.3 pg50[54]石斑鱼神经坏死病毒4.9×10-11拷贝60[55]蟾蜍米诺病毒5拷贝40[56]草鱼呼肠病毒7拷贝30[57]坏死病病毒7.5TCID5030[58]海豚链球菌12.4细胞60[59]HDA鳗弧菌30 ng130[60]副溶血性弧菌19.9 ng130[61]NASBA溶藻弧菌6.9×102 CFU90[62]副溶血性弧菌5.1×102 CFU90[63]草鱼呼肠病毒14拷贝300[64]CPA牡蛎疱疹病毒30拷贝60[65]神经坏死病毒101拷贝65[66]虾白斑综合征病毒101拷贝60[67]RPA传染性皮下及造血组织坏死病毒4拷贝7[68]虾白斑综合征病毒5拷贝6.5[69]Vibrio owensii2拷贝9[70]鲑鱼立克次氏体3×103拷贝60[71]第三类鲤科疱疹病毒10拷贝20[72]HDA技术目前仅在霍乱弧菌、副溶血性弧菌和鳗弧菌等水产病原体的检测上有应用.Tong et al[73]将HDA技术与TaqMan探针结合起来，建立了高效、快速的检测霍乱弧菌的方法.石琰璟等[61]根据副溶血性弧菌的tlh基因保守区设计引物,构建了等温条件下快速、特异地检测副溶血性弧菌的HDA检测方法，且特异性良好，检测限达到19.9 ng，其灵敏度与普通PCR相当.梁君妮等[60]根据鳗弧菌的toxR基因设计特异引物，通过对反应条件和体系的优化，成功构建了基于HDA的鳗弧菌快速检测方法.该方法能够特异地检出鱼类鳗弧菌，不会与其他鱼类病原体产生交叉反应；其检测限达到30 ng，使用构建的方法对人工污染样品的检测限为2.1×102 CFU，通过HDA对120份实际样品进行检测，与对比PCR检测技术的符合率为100%，阳性检出率优于传统的细菌培养法.秦胜利等[62]根据溶藻弧菌的hsp60基因为目的序列设计引物，构建了溶藻弧菌的NASBA快速检测体系.结果表明：该方法能特异地检测出6.9×102 CFU溶藻弧菌DNA，灵敏度比普通PCR方法高.倪鑫等[63]根据副溶血性弧菌的tlh基因为靶基因设计引物和探针，建立的NASBA检测方法对副溶血性弧菌的检测限为5.1×102 CFU，且与其他病原菌不会产生交叉反应.相比Wang et al[20]建立的LAMP检测副溶血性弧菌方法和石琰璟等[61]建立的HDA 检测副溶血性弧菌方法，LAMP检测方法的检测限和检测时间明显优于其他两种方法.2.2 在病毒快速检测上的应用LAMP技术在水产病毒病原体的检测上应用广泛，尤其在虾类病毒的检测上.如李红梅等[74]研究构建了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectioushypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的LAMP检测方法.结果表明：建立的LAMP检测方法在63 ℃条件下，能够在30 min内检测出106倍稀释的IHHNV基因组DNA，与27种水生动物及对虾常见病原的DNA均无交叉反应.CPA技术在水产病原体的检测上已有报道.赵小金等[65]依据牡蛎疱疹病毒魁蚶株(OsHV-1-SB)全基因组序列保守区设计引物，建立了CPA检测体系，并对反应体系和反应条件进行了优化.结果表明：该方法能够特异地检测出30拷贝的质粒DNA,使用建立的方法在对22份实际样品的检测中显示，该方法简单、迅速、特异性强.粟子丹[66]建立的赤点石斑鱼神经坏死病毒的CPA联合切向流试纸条检测方法(CPA-LFD)简单、快速，该方法能够特异地检测出10拷贝 RNA模板,比RT-PCR的检测限还要高出10倍，与常见的鱼类病毒性病原体均不会出现交叉反应.杨昊霖[67]根据对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的基因组保守区设计引物构建了CPA检测方法，并将该方法与WSSV的其他核酸扩增检测方法进行了比较.结果显示，构建的CPA检测方法对WSSV的检测限为10拷贝，灵敏度高于普通PCR检测方法，与qPCR和LAMP方法有着相同的灵敏度，与其他常见的虾类病毒IHHNV、HPV和副溶血性弧菌均没有交叉反应.2.3 在寄生虫快速检测上的应用核酸等温扩增技术在寄生虫的检测上亦有少量应用.Cai et al[23]利用LAMP技术检测鱼的肝脏吸虫——中华肝吸虫，根据组织蛋白酶B3基因序列设计引物，建立的LAMP检测技术的灵敏度是传统PCR技术的100倍.余传信等[75]和Kumagai et al[24]分别建立了日本血吸虫感染性钉螺的LAMP检测方法，能够在65 min内分别检测出100 fg和1 pg血吸虫DNA.余传信等[75]将建立的LAMP检测技术在30只感染性钉螺实际样品的检测中发现，LAMP的阳性检出率为93.33%，敏感性高于传统PCR的阳性检测率(83.33%).3 存在问题及展望3.1 在水产病原体快速检测上存在的问题通过对PubMed数据库近十年来的相关文献检索发现：众多核酸等温扩增技术在水产病原体快速检测上应用最多、最成熟的是LAMP技术(41篇)，在细菌、病毒和寄生虫的检测上都有应用，而其他等温扩增技术在水产病原体的检测上应用较少或至今仍没有应用.而PCR这一经典核酸扩增技术尽管需要依赖于精密仪器且存在一些其他方面的不足，但毋庸置疑仍是目前体外核酸扩增应用最为成熟和广泛的技术.在国内外有多种依据PCR技术开发的商业试剂盒可供水产病原体的检测使用，而对比核酸等温扩增技术，尽管也有相关文献报道，但大多数还是处于实验室研究阶段，仅LAMP和NASBA检测方法在致病菌检测上有相关少量的试剂盒可供使用,并建立了相应的进出口检验检疫标准(SN/T 2754和GB/T 19439—2004)；但其他大多数重要的水产病原体却未能建立核酸等温检测方法，可供使用的具有商业价值的水产病原体的试剂盒较少，核酸等温扩增技术的相关检测标准也不完善，这些都限制了等温扩增技术的使用和推广.3.2 展望进入21世纪，随着生物技术的迅速发展，催生了各种核酸扩增技术，但任何病原体检测方法的研发，都要以实际应用为最终目的.核酸等温扩增技术具有对设备要求简单、操作方便、在等温条件下即可迅速完成反应等优点，受到国内外研究者的重视.然而，核酸等温扩增技术要想真正做到适应于现场快速检测，笔者认为以下几个方面将是未来研发的重点.3.2.1 开发专门的引物设计软件目前，各种核酸等温扩增技术除了LAMP技术具有专门适用的引物设计软件外，其他技术均没有专用的引物设计软件供研究者使用，研究者往往是先根据PCR引物设计软件预评估设计引物的优劣，再进行实验筛选.根据本课题组的经验得知，PCR技术软件评出的结果与实际实验结果往往有很大的区别，这样就大大增加了引物设计的工作量和成本.因此根据各种核酸等温扩增技术开发出不同的引物设计软件，对于不同核酸等温扩增技术的推广是至关重要的一步，它的完善必将推动核酸等温扩增技术的跨越式发展.3.2.2 研发重要水产病原体的商业试剂盒目前，核酸等温扩增技术虽然在水产病原体的检测上有文献报道(表2)，但大多数重要的水产病原体还未有专门的商业试剂盒可供非专业的基层养殖场从业人员使用.因此，基于各种核酸等温扩增技术的扩增效率高、特异性强和灵敏度高等特点，开发出针对各种重要水产病原体的快速诊断试剂盒对于水产疾病的防控有重要的意义.3.2.3 结合不同技术各种核酸等温扩增技术尽管有诸多优点，但还存在各自的缺点，研究者需要将不同技术结合起来使用[76-78]，克服技术本身的缺点，使得结果读取更为方便和快捷.如将LFD技术与RPA技术结合起来，使得反应结果通过试纸条颜色变化即可读取，摆脱了对仪器的依赖，同时也不需要操作人有专业背景，特别适合我国基层养殖场使用.本世纪以来，迅速发展的水产养殖业满足了人类对蛋白质的需求.快速、简便和灵敏的核酸等温检测技术非常适用于现场快速检测及基层养殖场普及应用.核酸等温检测技术的不断完善、新的试剂盒出现以及与其他新技术的联合应用，将极大地推动水产养殖业的发展.参考文献【相关文献】[1] 刘英杰,刘永新,方辉,等.我国水产种质资源的研究现状与展望[J].水产学杂志,2015,28(5):48-55.[2] 黄辉，齐振雄,余露军,等.我国水产疫苗的研究现状[J].湖南农业科学,2010(21):136-138.[3] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18652—2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法[S].北京:中国标准出版社,2002.[4] 朱智壕,葛丽雅,涂晓波,等.等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展[J].食品安全质量检测学报,2015,6(12):4 787-4 794.[5] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. 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