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功能化磁性纳米粒子联合质谱技术用于金属硫蛋白的富集及鉴定研究

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DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.171285

功能化磁性纳米粒子联合质谱技术用于

金属硫蛋白的富集及鉴定研究

何新宇1摇王冰1摇周洋洋1摇卞晓军1,2,3摇颜娟*1,2,3

1(上海海洋大学食品学院,上海201306)摇摇2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306)3(农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海201306)

摘摇要摇金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一种具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质,因此常被作为一种重要的生物标志物用于水环境重金属污染评估。传统的金属硫蛋白富集检测方法耗时较长,操作复杂。本研究制备了金包覆四氧化三铁的核壳纳米粒子(Fe3O4@AuNPs),具有磁场的快速响应和特殊的

光学特性的优点,并且可利用Au鄄S的强亲和力实现纳米粒子对金属硫蛋白的快速富集,进一步将纯化的蛋白质通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI鄄TOF/MS)进行分析检测。结果表明,Fe3O4@Au纳米粒

子可以直接从复杂的溶液中富集MT,采用MALDI鄄TOF/MS鉴定分析,检出限达10fg/mL。

关键词摇金属硫蛋白;低丰度;磁性纳米材料;金纳米粒子;核壳结构;质谱

摇2017鄄10鄄01收稿;2018鄄02鄄27接受本文系国家自然科学基金项目(Nos.21775102,21405167)和海洋工程国家重点实验室(上海交通大学)开放课题项目(No.1609)资助*E鄄mail:j鄄yan@shou.edu.cn1摇引言

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)广泛存在于生物界,其金属含量高,无芳香氨基酸,富含半胱氨

酸,是一种功能独特的低分子量(<9000Da)金属结合蛋白[1]。目前研究发现,除鸟类外,几乎能从所

有的哺乳动物、鱼类、无脊椎动物、两栖类和某些植物以及真核、原核微生物中分离得到MT,且不同

种属、不同组织来源的MT具有相似的氨基酸顺序。MT最为显著的特点是它与金属离子有很强的鳌

合力[2],并且MT在生物体内可被环境中的重金属诱导,欧共体及某些国际科学组织将其作为水环境

中重金属污染评估的生物标志物[3]。因此,建立MT的富集检测方法对环境治理、食品安全检测甚至

疾病诊断等领域都具有重要的现实意义。然而,目前对MT的研究面临很多问题:首先,MT丰度很低,

很难直接从复杂的生物样品中直接检测到MT;其次,目前大多数研究是通过对动物体利用重金属胁迫

诱导,再从动物体的消化腺、肝胰腺等部位提取MT进行研究。传统的提取方法主要是Tris鄄HCl缓冲溶

液或蔗糖溶液进行匀浆离心[4,5],之后再通过凝胶过滤和离子交换相结合的层析法分离纯化,最终利用

金属亲和层析、巯基和蛋白质检测等方法鉴定[6~8]。这种传统操作方法耗时较长,操作复杂,样品用量

以及损耗较大,且对人员的操作技术有较高要求。因此,发展高效特异且操作简便的MT富集检测方法

已经成为相关研究领域的热点和难点。

质谱(Massspectrometry,MS)技术为蛋白质检测技术提供了新的发展契机。质谱技术的高准确性、

高灵敏性和自动化操作等优点,使蛋白质的检测鉴定变得较为方便简单[9,10]。即便如此,这种技术也仍

然面临着不容忽视的挑战:蛋白质样品成分复杂、丰度差别极大,导致即使使用高灵敏的质谱技术,有

时也难以获得准确有效的分析鉴定结果[11]。因此,在对蛋白质进行鉴定之前,通常要对其进行预处

理。目前常用的预处理方法主要是超滤离心法、有机溶剂沉淀法、凝胶过滤色谱法等[12~14];尤其是对

于具备重要临床诊断意义的低丰度蛋白而言,预处理的效果会极大地影响鉴定结果[15]。然而,对MT

进行预处理的传统方法耗时久,样品损耗大,操作繁琐,亟需开发低丰度MT富集新方法。

纳米材料为发展新的蛋白质富集方法提供了新思路。随着纳米材料在可控合成、组装和修饰等方

面的快速发展,纳米材料在生物技术中的应用范围也越来越广[16~19],包括一些直接将DNA本身作为一

种纳米材料的应用研究[20~22],越来越多的功能化纳米材料被应用于药物释放[23,24]、生物大分子分离、第46卷2018年7月摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇分析化学(FENXIHUAXUE)摇研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第7期1069~1076生物传感器[25]和固定化酶等方面。近年来,基于纳米金属粒子和磁性纳米材料的复合纳米粒子的制备

及应用成为纳米材料领域中的研究热点。这种复合纳米粒子不但表现出在外加磁场中的磁响应性、化

学稳定性、生物相容性,还具有独特的光学性质及与巯基化试剂的反应活性[26~28]。它的合成方法主要

有微乳液法、组装法与种子生长法等[29],通过不同的合成方法,可以制备得到不同结构和组成、不同尺

寸和形状的复合纳米粒子,如核壳结构、哑铃状等。Fe3O4@Au核壳纳米粒子是在磁性纳米粒子表面包

WashMagneticfield

Detection80604020060008000100001200014000m/zIntensity(%)

Fe3O4@AuNPsMTBovineserumalbumin

图1摇Fe3O4@AuNPs富集MT过程示意图

Fig.1摇Schematicillustrationoftheenrichmentandidentificationofmetallothionein(MT)withFe3O4@AuNPs覆Au壳层制备而得,广泛应用在磁性生物分离[30]、

生物传感检测[31,32]、核磁共振成像(MRI)造影剂[33]

以及磁靶向药物输送等诸多领域[27,34~36]。磁性纳米

粒子的磁分离特性与纳米金的良好生物相容性使得Fe3O4@Au核壳纳米粒子适用于低丰度蛋白的富集

与检测。然而,将其应用于MT的富集并与MALDI鄄TOF/MS联用进行蛋白鉴定的相关研究尚未见报道。

本研究利用Fe3O4@Au核壳纳米粒子和质谱技

术联用进行了MT的富集和分析鉴定(如图1)。首

先合成Fe3O4纳米粒子,并通过柠檬酸钠的还原作

用,在Fe3O4表面包覆一层金壳,获得金磁核壳纳米

粒子,然后利用核壳粒子与蛋白形成的Au鄄S键与磁

分离特性,对MT进行富集,实现MT的快速分离富

集,利用MALDI鄄TOF/MS对富集的蛋白进行鉴定分

析。结果表明,基于Fe3O4@Au核壳纳米粒子和质谱技术联用的MT富集检测方法具有良好的检测特异

性和灵敏度(检出限为10fg/mL)。本研究为低丰度痕量蛋白质的研究提供了新方法,在蛋白质组学等

相关研究领域也具有较为广阔的应用前景。

2摇实验部分

2.1摇仪器与试剂NicoletiS5红外光谱仪(美国ThermoFisher公司);JEM鄄2010透射电子显微镜(日本电子公司);

RW20DZM.n电子恒速搅拌器(德国IKA公司);UV鄄2540紫外可见分光光度计(日本岛津公司);BrukerDaltonicsMALDI鄄TOF/MS(德国Bremen公司);ZetasizerNano鄄ZS90电位仪(Malvern公司);XRD

(D2Phaser,Bruker公司)。28%(m/V)氨水溶液、FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O(国药集团化学试剂有限公司);HAuCl4·3H2O

(99.9%,美国StremChemical公司);牛血清白蛋白(BSA,生工生物工程(上海)股份有限公司);标准

兔肝(MT,99%,上海源叶生物公司),以上试剂均为分析纯。2,5鄄二羟基苯甲酸(DHB)、三氟乙酸(TFA)均为质谱纯(Sigma鄄Aldrich公司)。实验用水均为去离子水。

2.2摇实验方法2.2.1摇Fe3O4纳米粒子的合成摇参照文献[37]的方法,首先称取1.622gFeCl3·6H2O和0.9941gFeCl2·4H2O,加入40mL去离子水,然后将反应混合物加热并进行机械搅拌,试剂完全溶解且沸腾后,

立即加入5mL氨水溶液(28%,m/V)。继续加热10min后,添加4.4g柠檬酸钠,继续加热搅拌30min,冷却到室温,用去离子水彻底清洗沉淀物3次,定容至40mL,得到Fe3O4纳米粒子的溶液。2.2.2摇Fe3O4@Au纳米粒子的合成摇参照文献[37]的方法,100mL去离子水中加入3mL1%氯金酸

溶液,加热搅拌直到沸腾。快速添加5mL预先合成的Fe3O4纳米粒子溶液,快速搅拌,可以清楚地看到Fe3O4纳米粒子的颜色发生快速变化,由黑色变为红棕色。20min后停止加热,继续搅拌,直到溶液冷却到室温。

用永磁体沉淀和分离合成的Fe3O4@Au纳米粒子,然后用去离子水洗涤5次,再次在去离子

水中分散,配制成10mLFe3O4@Au溶液,呈红棕色。

2.2.3摇Fe3O4@Au对MT的富集摇参照文献[37]的方法,配制BSA(1mg/mL)溶液,在BSA溶液中加0701摇摇分析化学第46卷入不同含量的MT,充分混匀,制备MT和BSA的蛋白混合物溶液。将Fe3O4@Au(10滋L)分散在不同配

比的蛋白混合溶液中,振荡5min后,磁场分离,用去离子水洗涤3次。采用MALDI鄄TOF/MS进行检测,

基质为乙腈鄄水(70颐30,V/V)溶液,其中含有10mg/mLDHB及0.1%TFA,吸取1滋L样品点在靶上,

环境条件下自然晾干,然后吸取1滋L基质覆盖在样品上,环境条件下自然晾干。检测中不同位置收集

总点数为800次,使用激光频率为20Hz,光强可变化。

3摇结果与讨论

3.1摇Fe3O4@Au核壳纳米颗粒的表征

3.1.1摇TEM分析摇目前,制备纳米Fe3O4的方法有很多,如水热反应法、中和沉淀法、化学共沉淀法、

沉淀氧化法、微波辐射法等,其中以化学共沉淀法最为简便。本研究中,采用化学共沉淀法制备的纳米Fe3O4结晶度好、粒径分布较为均一((8依2)nm),达到了超顺磁临界尺寸[38],超声分散后,在水相中形

成黑色胶体,且在外加磁场下,具备较好的磁响应性(图2A和B)。柠檬酸钠还原氯金酸,混合溶液中

的纳米Fe3O4粒径发生变化。从TEM图(图2C鄄D)可见,纳米Fe3O4表面包覆连续壳层,制备的核壳纳

米粒子粒径为(25依2)nm,纳米水溶液无明显沉淀,呈现澄清红棕色。同时具有良好的磁响应性,此实

验结果与相关文献[35]一致。对Fe3O4@Au核壳纳米粒子进行了高分辨精细分析,可以清晰分辨出纳

米粒子的核壳结构(图2D及插图)。

ABDC

100nm100nm20nm20nm10nm6.16nm

图2摇TEM表征结果图以及溶液样品:A,B.Fe3O4纳米颗粒;C,D.Fe3O4@Au纳米颗粒;D图右下角

为Fe3O4@Au纳米颗粒的HRTEM图

Fig.2摇Transmissionelectronmicroscopy(TEM)imagesandsolutionsamplesofFe3O4NPs(AandB)and

Fe3O4@AuNPs(CandD);AtthelowerrightofthefigureDisHRTEMimageofFe3O4@AuNPs

3.1.2摇紫外鄄可见吸收光谱分析摇紫外鄄可见吸收光谱的表征结果表明,磁分离洗涤过程,两种颗粒均

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有机化合物的鉴定质谱法与核磁共振谱法的联用

有机化合物的鉴定质谱法与核磁共振谱法的联用

有机化合物的鉴定质谱法与核磁共振谱法的联用

有机化合物的鉴定一直是有机化学研究和应用中至关重要的一环。为了准确快速地确定有机化合物的结构和成分，科学家们开发了许多实验方法。本文将介绍有机化合物的鉴定质谱法与核磁共振谱法的联用，以及这种联用方法在化学研究中的应用。

质谱法是一种能够测量化合物的质量和分子结构的方法。通过质谱仪，化学家们可以将有机化合物分解成离子，并记录下离子的质量谱图。质谱图的峰位和相对强度可以提供有机化合物分子的质量和结构信息。质谱法的优点在于快速、灵敏和高分辨率，能够对不同的有机化合物进行快速鉴定。

然而，质谱法也存在一些局限性。例如，在质谱图中，分子的碳氢骨架信息无法直接获得，只能根据质谱图的衍射峰进行推测。此外，质谱法对于化合物的可检测范围也有限。

而核磁共振谱法（NMR）是另一种常用于有机化合物鉴定的方法。核磁共振谱法利用分子中原子核在磁场中的共振吸收行为来分析物质的结构和环境。其中最常用的是氢核磁共振谱（1H-NMR）。

核磁共振谱法的优点在于能够提供化合物的细节信息，如亚基的数量、位置和相对位置，以及官能团的结构和位置。通过对样品的波谱图进行解析，化学家们可以确定有机化合物的分子式、结构和立体构型。核磁共振谱法也是有机化学研究中不可或缺的一种方法。 然而，核磁共振谱法也存在一些缺点。首先，核磁共振谱的仪器设备成本较高，操作和维护也较为复杂。其次，核磁共振谱法的灵敏度相对较低，需要高纯度的样品进行测量。另外，复杂的有机化合物在核磁共振谱上产生的峰位数量较多，分析解读也较为繁琐。

为了克服质谱法和核磁共振谱法各自的缺点，化学家们开始尝试将两种方法联用。质谱法和核磁共振谱法的联用能够充分发挥两种方法的优点，提高鉴定的准确性和可靠性。在联合分析中，质谱法提供了有机化合物的分子式、分子量和分子结构信息，而核磁共振谱法则提供了有机化合物的详细结构信息，如官能团和立体构型。

联用质谱法和核磁共振谱法的应用非常广泛。例如，在药物研发中，科学家们可以通过质谱法和核磁共振谱法联合鉴定药物的结构和纯度。在环境监测中，联用方法可以帮助分析有机污染物的种类和浓度。在天然产物的研究中，联用方法可以帮助识别复杂混合物中的有机成分，并推测出其结构和来源。

诺氟沙星磁分子印迹纳米粒子的制备及其富集分离

诺氟沙星磁分子印迹纳米粒子的制备及其富集分离

响[J].食品工业,2016,37(12):157-162[18]吴兴利,边连全.感官评价原理与实践在肉质评价中的应用[J].

中国家禽,2004(19):29-30[19]魏心如,李伟明,闫海鹏,等.冷却鸡肉肉色色差计评定方法标

准化[J].食品科学,2014,35(24):189-193[20]中国国家标准化管理委员会.食品安全国家标准食品微生物学

检验菌落总数测定:GB/T4789.2—2010[S].北京:中国标准出版社,2010

收稿日期：2019-10-12食品研究与开发云oodResearchAndDevelopment

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2020.18.009

诺氟沙星磁分子印迹纳米粒子的制备

及其富集分离

黄昭，李跑，曹亚男，李佳银，刘霞*

（湖南农业大学食品科技学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

摘要：以氨基修饰的Fe3O4纳米粒子（Fe3O4@NH2NPs）为载体、诺氟沙星（norfloxacin，NOR）为模板分子、多巴胺

（dopamine，DA）为功能单体和交联剂，通过优化制备条件获得特异性识别NOR的磁性分子印迹纳米粒子（magneticmolecularlyimprintedpolymersnanoparticles，MMIPsNPs）。结果表明，当溶剂乙醇-水体积比为1颐1，Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA添加量分别为500、15、134mg，洗脱液乙醇-乙酸溶液体积比为97颐3时，制备的MMIPsNPs对NOR的吸附

效率最高。当4mgMMIPsNPs吸附1mL0.02mg/mL的NOR60min时，其吸附效率为94.61%，相对标准偏差为0.79%，是磁性非分子印迹纳米粒子（magneticnon-molecularimprintedpolymersnanoparticles，MNIPsNPs）的2.18倍。当15mgMMIPsNPs吸附1mL0.1mg/mLNOR60min时，其吸附效率可达到99.17%，相对标准偏差为1.03%。

ZIF-8_封装AuNCs_荧光传感器用于铁离子的检测

ZIF-8_封装AuNCs_荧光传感器用于铁离子的检测

第53卷第3期 辽 宁 化 工 Vol.53，No. 3 2024年3月 Liaoning Chemical Industry March，2024

基金项目： 国家自然科学基金（项目编号：22004046）。 收稿日期： 2023-07-05 通信作者： 马品一，男，博士，高级工程师，研究方向：光学探针与传感分析。 ZIF-8封装AuNCs荧光传感器

用于铁离子的检测

马品一，刘佳宜，高德江，费强，宋大千 （吉林大学化学学院， 吉林 长春 130012）

摘 要：介绍一个适合于本科教学使用的综合创新实验，设计合成了一种荧光传感器AuNCs@ZIF-8，并将其用于铁离子（Fe3+）的检测。MOFs具有高效吸附、聚集检测物的特点，因此选择将AuNCs封装到ZIF-8中，从而实现目标物的定量检测。封装后，由于AuNCs具有AIE特性，所以AuNCs@ZIF-8的荧光强度明显增强。ZIF-8是一种多孔材料，加入Fe3+后，Fe3+能够进入ZIF-8内部，导致AuNCs的荧光被Fe3+猝灭，成功用于实际水样中Fe3+的检测。尽管该实验步骤复杂并涉及新型纳米材料的合成和表征，但它成功地整合了无机化学、分析化学以及材料化学的相关知识，且操作难度适宜。这为提升学生的动手能力和科技前沿理解提供了一次宝贵的机会。 关 键 词：铁离子（Fe3+）；荧光传感器；综合创新实验；金纳米团簇（AuNCs）；金属有机骨架（MOFs） 中图分类号：O6 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2024）03-0329-04

铁离子（Fe3+）是一种常见的金属离子，其在工业废水中含量较多，若无节制地排放，会导致水体和土壤污染，从而对环境和生物体造成重大危 害[1]。尽管目前已有多种Fe3+的检测方法，如电化学方法、液相色谱法、原子光谱法、分光光度法、荧光传感器法等[2]，但荧光法以其低成本、快速响应以及高灵敏度等优势突显[3]。荧光光谱是分子光谱领域的重要内容，许多化学专业的高年级本科生热切期望能进行一些具备理论深度和操作挑战、内容新颖并贴近科技前沿的综合实验，因为这对于拓宽他们的学术视野、帮助他们进行研究生深造以及职业规划具有深远的影响[4]。为此，设计了一种基于荧光光谱技术的Fe3+荧光传感器实验。 该荧光传感器涉及两种新型纳米材料。首先，金纳米团簇（AuNCs）是一种新型无机纳米材料[5]，其低毒性、表面功能化的便利性以及良好的生物相容性使得其近年来受到研究者们的广泛关注。AuNCs在生物成像、肿瘤诊断治疗、化学传感等领域都具有潜在的广泛应用[6-7]。其次，金属有机骨架（MOFs）是一种有机-无机杂化材料[8]，MOFs既具有有机材料的特性，也具备无机材料的优点，例如生物相容性好、孔径和孔道结构可调、比表面积大等，使得其在催化、吸附、分子和离子检测、肿瘤治疗等领域都有着广泛的应用[9-10]。 在本实验中，设计合成了一种荧光传感器AuNCs@ZIF-8。其合成步骤简便且合成速度快。通过将AuNCs封装在ZIF-8中，相比封装前，封装后的AuNCs的荧光强度明显增强。此外，MOFs不仅能吸附并富集检测物，还能有效防止封装的纳米材料发生聚集。检测原理是基于Fe3+能够有效猝灭AuNCs的荧光。ZIF-8作为一种多孔材料，在加入Fe3+后，Fe3+能进入其孔道内。AuNCs表面具有大量的氨基和羧基，氨基中的氮原子、羰基中的氧原子能与Fe3+发生配位反应，导致AuNCs的荧光被Fe3+猝灭。随着Fe3+的加入，AuNCs@ZIF-8的荧光强度逐渐减弱，由此实现对Fe3+的检测，检测原理示意图如图1 所示。尽管本实验步骤较多，但其内容新颖，综合性强，操作难度适中，并涉及两种新型纳米材料的合成和表征，对于培养学生动手能力、了解科技前沿，以及灵活运用实验知识都十分适合。实验总学时为6 h，可以灵活掌握，既可以单次完成，

应用磁金纳米粒子研究牛血清白蛋白与牛蒡子苷之间的相互作用

应用磁金纳米粒子研究牛血清白蛋白与牛蒡子苷之间的相互作用

应用磁金纳米粒子研究牛血清白蛋白与牛蒡子苷之间的相互作用

王宁;刘忠英;金蕊;熊慧霞;孙颖

【摘 要】建立了用于确定血清白蛋白与中药有效成分相互作用结合常数和结合位点数的新方法.利用磁金纳米粒子的超顺磁性和生物相容性,将其作为白蛋白的载体.将牛血清白蛋白固定在磁金纳米粒子上,白蛋白与药物结合后,通过外加磁场将磁金纳米粒子-白蛋白-药物复合物与游离药物分离,通过荧光光谱法得到的游离药物浓度,根据Scatchard方程直接计算出白蛋白与药物的结合常数和结合位点数.本方法用于研究牛血清白蛋白和牛蒡子苷之间的相互作用,结合常数为2.09×105 L/mol,结合位点数为16.63.通过外加磁场作用,使白蛋白从样品溶液中分离出来,样品溶液中只有药物,消除了测定药物时白蛋白的影响,因此所求得的结合位点的数目更准确.实验结果表明,本方法可用于测定分子间非共价结合的结合常数和结合位点数,同时为研究中药有效成分与血清白蛋白相互作用提供了参考.

【期刊名称】《分析化学》

【年(卷),期】2015(043)004

【总页数】6页(P528-533)

【关键词】磁金纳米粒子;牛血清白蛋白;结合常数;荧光光谱

【作 者】王宁;刘忠英;金蕊;熊慧霞;孙颖 【作者单位】吉林大学药学院,长春130021;吉林省人民医院科教科,长春130021;吉林大学药学院,长春130021;吉林大学化学学院,长春130012;吉林大学化学学院,长春130012;吉林大学化学学院,长春130012

【正文语种】中 文

磁金纳米粒子是兼有磁纳米粒子和金纳米粒子优点的复合纳米材料,金包覆的磁纳米粒子(Fe3O4/ Au)在水相中分散良好,不易受酸碱腐蚀,在常温下表现出良好的顺磁性,并具有稳定的光学吸收特点,适用于传感器、生物医学等领域[1,2]。其金表面可以通过静电作用直接与抗体、细胞以及DNA等生物活性分子连接,且有利于保持生物活性。Fe3O4/Au复合粒子的超顺磁性也为样品的分离、富集、固定等提供了方便,是一种理想的载体。