中国畜牧兽医 2024,51(4):1329-1338C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e肉鸭肠道微生物空间异质性分析牟启铭,刘大鹏,于思梦,鲁美希,刘 同,王 真,唐贺贺,侯水生,周正奎(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,农业农村部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室,北京100193)摘 要:ʌ目的ɔ本试验旨在通过宏基因组测序㊁物种注释和功能注释比较肉鸭不同肠段的微生物群落多样性㊁种类㊁相对丰度差异,探究肉鸭肠道微生物的空间异质性㊂ʌ方法ɔ选取饲养于相同环境的6周龄北京鸭和连城白鸭共6个个体,依次采集其十二指肠㊁空肠㊁回肠和盲肠内容物,基于宏基因组测序方法获得肠道微生物的种类和相对丰度㊂基于微生物丰度表,利用w i l c o x o n 秩和检验进行不同肠段的优势微生物㊁微生物种类数㊁微生物相对丰度㊁微生物群落多样性和微生物功能多样性差异比较,并利用t 检验筛选了北京鸭和连城白鸭各肠段的显著差异菌属㊂ʌ结果ɔ本试验共鉴定到45个菌门㊁84个菌纲㊁186个菌目㊁418个菌科㊁1400个菌属和3467个菌种㊂其中4个肠段的优势菌门均为厚壁菌门(F i r m i c u t e s )㊁拟杆菌门(B a c t e r o i d e t e s )㊁变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a )和放线菌门(A c t i n o b a c t e r i a ),四大菌门在不同肠段之间分布存在差异㊂4个肠段的优势菌属均为拟杆菌属(B a c t e r o i d e s )和P h o c a e i c o l a 等10个相同菌属,而且优势菌属的种类和丰度在不同肠段存在组间差异㊂从十二指肠到盲肠,微生物的组成㊁相对丰度和群落多样性变化显著(P <0.05),其中十二指肠㊁空肠和回肠的微生物组成相似性很高,与盲肠微生物存在明显分离;同时,盲肠微生物的群落多样性也极显著高于其他肠段(P <0.01)㊂与十二指肠㊁空肠㊁回肠相比,盲肠微生物的细菌趋化性㊁氨基糖㊁核苷酸糖代谢脂肪酸的生物合成等代谢通路均上调,且盲肠富集到31个北京鸭和连城白鸭差异菌属,数量高于十二指肠㊁空肠㊁回肠㊂ʌ结论ɔ肉鸭盲肠富集的微生物数量㊁相对丰度㊁群落多样性均高于十二指肠㊁空肠和回肠㊂本研究结果为解析肉鸭肠道微生物调控机制和精准调控肉鸭的能量代谢水平和免疫机能提供理论依据,为肉鸭肠道微生物的进一步研究提供借鉴㊂关键词:鸭;肠道微生物;宏基因组;空间异质性中图分类号:S 834文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.001 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-20基金项目:中国农业科学院科技创新工程重大科研任务(C A A S -Z D RW 202104)联系方式:牟启铭,E -m a i l :m y s m q m 1027@126.c o m ㊂通信作者周正奎,E -m a i l :z h o u z h e n gk u i @c a a s .c n S p a t i a lH e t e r o g e n e i t y A n a l ys i s o fG u tM i c r o b i o t a i n M e a tD u c k s MU Q i m i n g ,L I U D a p e n g ,Y US i m e n g ,L U M e i x i ,L I U T o n g,WA N GZ h e n ,T A N G H e h e ,H O US h u i s h e n g ,Z H O UZ h e n gk u i (S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lG e n e t i c s ,B r e e d i n g a n dR e p r o d u c t i o n (P o u l t r y ),M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,I n s t i t u t e o f A n i m a lS c i e n c e o f CA A S ,B e i j i n g 100193,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o c o m p a r e t h e d i v e r s i t y ,s pe c i e s a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e o fm i c r o b i a l c o m m u n i t y i nd if f e r e n t i n t e s t i n a l s eg m e n t s o fm e a t d u c k s b y m e t a ge n o m e s e q u e n c i n g ,s p e c i e s a n n o t a t i o n a n df u n c t i o n a l a n n o t a t i o n ,s o a s t o e x p l o r e t h e s p a t i a l h e t e r og e n e i t y o f g u tm i c r o b i o t a i nm e a t d u c k s .ʌM e th o d ɔT h e c o n t e n t s o f d u o d e n u m ,j e ju n u m ,i l e u ma n dc e c u m w e r e c o l l e c t e df r o m 6-w e e k -o l d B e i j i n g d u c k sa n d L i a n c h e n g W hi t ed u c k sr a i s e di nt h es a m e e n v i r o n m e n t i n t u r n ,a n dt h es p e c i e sa n dr e l a t i v ea b u n d a n c eo f g u tm i c r o b i o t aw e r eo b t a i n e db y m e t a g e n o m e s e q u e n c i n g.B a s e d o n t h em i c r o b i a l a b u n d a n c e t a b l e ,w i l c o x o n r a n k s u mt e s tw a s u s e d t oc o m p a r et h e d i f f e r e n c e s o fd o m i n a n t m i c r o o r g a n i s m s ,m i c r o b i a ls pe c i e s ,m i c r o b i a lr e l a t i v e中国畜牧兽医51卷a b u n d a n c e,m i c r o b i a l c o m m u n i t y d i v e r s i t y a n dm i c r o b i a l f u n c t i o n a l d i v e r s i t y i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s,a n d t t e s tw a su s e dt os c r e e nt h es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tb a c t e r i a l g e n e r a i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s o f P e k i nd u c k s a n dL i a n c h e n g W h i t e d u c k s.ʌR e s u l tɔ45p h y l a,84c l a s s e s,186 o r d e r s,418f a m i l i e s,1400g e n e r aa n d3467s p e c i e s w e r ei d e n t i f i e di nt h i se x p e r i m e n t.T h e d o m i n a n t p h y l ao f t h e f o u r i n t e s t i n a l s e g m e n t sw e r eF i r m a c u t e s,B a c t e r o i d e s,P r o t e o b a c t e r i aa n d A c t i n o m y c e t e s,a n d t h e d i s t r i b u t i o n o ft h ef o u r p h y l ai n d i f f e r e n ti n t e s t i n a ls e g m e n t s w a s d i f f e r e n t.B a c t e r o i d e s a n d P h o c a e i c o l a w e r e t h e d o m i n a n t g e n e r a i n t h e f o u r i n t e s t i n a l s e g m e n t s, a n dt h es p e c i e sa n da b u n d a n c eo ft h ed o m i n a n t g e n e r a w e r ed i f f e r e n ta m o n g t h e g r o u p so f d i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s.F r o m d u o d e n u mt oc e c u m,t h ec o m p o s i t i o n,r e l a t i v ea b u n d a n c ea n d c o m m u n i t y d i v e r s i t y o f m i c r o b i o t a c h a n g e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.05),a n d t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o no fd u o d e n u m,j e j u n u m a n di l e u m w a sh i g h l y s i m i l a ra n do b v i o u s l y s e p a r a t e df r o m c e c u m m i c r o b i o t a.A tt h es a m et i m e,t h ec o m m u n i t y d i v e r s i t y o fc e c u m m i c r o b i o t a w a sa l s o s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f o t h e r i n t e s t i n a l s e g m e n t s(P<0.01).C o m p a r e dw i t hd u o d e n u m, j e j u n u ma n d i l e u m,t h em e t a b o l i c p a t h w a y s s u c ha sb a c t e r i a l c h e m o t a x i s,a m i n os u g a r,n u c l e o t i d e s u g a rm e t a b o l i z i n g f a t t y a c i db i o s y n t h e s i s o f c e c u m m i c r o b i o t aw e r e u p-r e g u l a t e d,a n d31d i f f e r e n t b a c t e r i a g e n e r a o f B e i j i n g d u c k s a n dL i a n c h e n g W h i t ed u c k sw e r e e n r i c h e d i nc e c u m,w h i c hw e r e h i g h e r t h a n t h a t o f d u o d e n u m,j e j u n u ma n d i l e u m.ʌC o n c l u s i o nɔT h e q u a n t i t y,r e l a t i v e a b u n d a n c e a n dc o m m u n i t y d i v e r s i t y o f m i c r o b i o t ai n c e c u m o f m e a td u c k s w e r e h i g h e rt h a n t h o s ei n d u o d e n u m,j e j u n u m a n di l e u m,w h i c h p r o v i d e dt h e o r e t i c a lb a s i sf o ra n a l y z i n g t h er e g u l a t i o n m e c h a n i s mo f g u tm i c r o b i o t a i n m e a td u c k s,a c c u r a t e l y r e g u l a t i n g e n e r g y m e t a b o l i s ml e v e l a n d i m m u n e f u n c t i o n o fm e a t d u c k s,a n d p r o v i d e d r e f e r e n c e f o r f u r t h e r s t u d y o f g u tm i c r o b i o t a i nm e a t d u c k s.K e y w o r d s:d u c k;g u tm i c r o b i o t a;m e t a g e n o m e;s p a t i a l h e t e r o g e n e i t y肠道是重要的消化器官,从胃部的幽门端开始,一直延伸到肛门,构成了动物消化系统中最长的一段[1]㊂小肠上皮黏膜和黏膜下层向肠腔处伸出大量的微绒毛,增大了营养素的吸收面积;且肠道中有丰富的淀粉酶㊁蛋白酶㊁脂肪酶等,参与水分㊁微量矿物元素㊁脂肪㊁淀粉和蛋白质等物质的消化㊁吸收[2]㊂畜禽的肠道分为十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠等肠段,其作用机制有明显差异[3-4]㊂更重要的是,肠拥道中栖息着大量微生物,它们和宿主消化系统构成了一个统一的整体,参与宿主的营养素消化吸收,并且和宿主的免疫调控㊁生长调控㊁能量代谢等各种生理生化功能有着密切的关系[3]㊂由于肠道微生物对生理生化功能存在重要的作用,近年来,肠道微生物研究受到了广泛的关注,在水禽肠道微生物的研究中也取得了相应的进展,特别是在肠道微生物免疫作用以及饲粮养分如何调节肠道微生物进而影响机体生理代谢等方面取得了较多成果㊂研究发现,蛋鸭盲肠中产甲烷类细菌的相对丰度与卵巢重呈正相关,乳酸菌属相对丰度与脾脏重呈显著正相关[5],这些发现为提高肉鸭的繁殖性能和免疫能力提供了崭新的思路;而且其他研究发现,随着光照时间的增加,鹅各个肠段拟杆菌门的相对丰度上升,其中拟杆菌门和畜禽消化吸收能力有密切关系[6],这对畜禽生产性能的提升提供了重要参考㊂但是,肉鸭不同肠段的空间分布差异目前研究较少,选择哪个肠段进行微生物研究仍然处于未知阶段㊂因此,肉鸭不同肠段的微生物群落结构的差异性和微生物种类㊁相对丰度的差异性需要进一步探究㊂随着宏基因组测序技术快速兴起,为微生物物种注释提供了更加精确的研究方法[7]㊂为了探究肉鸭肠道微生物的空间异质性差异,本研究以北京鸭和连城白鸭为研究对象,通过采集十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠的内容物进行微生物宏基因组测序和物种注释,分析肉鸭肠道不同肠段微生物的组成差异,为理解肉鸭的肠道微生物特征和功能机制等提供一定的理论依据㊂1材料与方法1.1试验动物及表型采集本试验鸭饲养至6周龄,随机挑选饲养状况相03314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析同㊁无疾病的6只雄性个体(3只北京鸭和3只连城白鸭),测定体重㊁料重比,屠宰后采集十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠的内容物㊂用1.5m L无菌冻存管分装后,立即存入液氮,后移入 80ħ保存,用于D N A提取㊂1.2肠道内容物D N A提取、质控及物种注释采用C T A B法提取24个肠道内容物样品的总D N A,使用琼脂糖凝胶电泳鉴定D N A是否降解或出现污染,共计23个样品质检合格㊂将通过检测的样品D N A利用Q u b i t B R稀释到170n g/μL以下,并进行建库和宏基因组二代高通量测序,单个样品的宏基因组测序数据量不少于5G b㊂对于获得的宏基因组r a wr e a d s,首先利用f a s t p(v e r0.20.1)去除接头序列㊁低质量序列(-u20)和低长度序列(--l e n g t h_r e q u i r e d30),获得c l e a nr e a d s[8]㊂将c l e a n r e a d s利用B WA-m e m(v e r0.7.17-r1188)软件比对到I A S C A A S_P e k i n g D u c k_P B H v1.5北京鸭参考基因组(G C A_003850225.1)上,去除宿主基因组污染序列[9]㊂利用K a i j u(v e r1.9.2)比对到K a i j u_ R e f s e q参考序列数据库进行物种组成注释[10]㊂为了进一步降低数据噪音的影响,本研究对物种组成进行了质控,质控标准为:①相对丰度> 10-5;②检出率>25%㊂获得门㊁纲㊁目㊁科㊁属㊁种水平的微生物含量百分比表㊂利用R语言g g p l o t2包(v e r3.4.1)绘制门水平物种累计柱状图,获得十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠的菌门水平的物种组成结果㊂1.3微生物种类差异分析利用获得的物种组成相对丰度表中的微生物比对r e a d s数进行对数转换,并计算获得微生物相对丰度表㊂使用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的d i v e r s i t y函数计算菌门水平的各肠段微生物群落的菌门数,并进行K r u s k a l-W a l l i s多样本差异检验[11],查看不同肠段微生物菌门数差异结果,并结合菌门水平物种分布维恩图和物种相对丰度热图筛选出存在差异分布的微生物㊂1.4微生物群落结构差异分析使用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的d i v e r s i t y 函数计算菌属水平的各肠段微生物群落的A l p h a 多样性和B e t a多样性差异;利用m u l t c o m p包(v e r 1.4-23)对各肠段微生物A l p h a多样性结果进行单因素方差分析[11-14],利用S h a n n o n指数作为A l p h a 多样性的指标㊂使用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的v e g d i s t函数基于微生物相对丰度计算各样品两两之间的微生物B r a y-C u r t i s距离,基于计算获得的B r a y-C u r t i s距离矩阵进行主坐标分析(p r i n c i p a l c o o r d i n a t e a n a l y s i s,P C o A)㊂对所有的样品进行聚类,检验肉鸭不同肠段的微生物群落结构之间的差异[11-14]㊂利用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的a n o s i m函数分别对各肠段微生物的B r a y-C u r t i s距离矩阵进行相似性分析(a n a l y s i so fs i m i l a r i t i e s, A N O S I M),随机置换999次,计算得到R值和P 值,以进一步评估不同肠段之间的微生物差异是否大于组内差异㊂基于菌科水平和菌种水平的相对丰度结果,进行主成分分析(P C A),验证其他分类水平上的肠道微生物的群落结构差异㊂1.5微生物功能注释使用h u m a n n(v e r3.8)将r e a d s比对到c h o c o p h l a n泛基因数据库㊁u n i r e f基因家族数据库㊁u t i l i t y_m a p p i n g注释数据库,并转换成K E G G注释结果㊂将盲肠微生物与十二指肠㊁空肠㊁回肠的功能注释结果进行比较,并根据P值筛选前三十的差异结果,用g g p l o t2绘制成气泡图,证明肠道微生物在功能多样性层面的差异㊂1.6微生物组间比较为比较北京鸭和连城白鸭的差异菌属,基于肠道微生物菌属水平的相对丰度表,通过t检验方法,并以P<0.05为限制指标,筛选出北京鸭和连城白鸭在各肠段的差异菌属,揭示其在北京鸭中的上调或下调类型㊂2结果2.1肠道微生物宏基因组测序数据概述质检合格的肠道内容物样品共计23个,质控后共计21676685条宏基因组测序高质量r e a d s成功比对到了R e f s e q非冗余参考序列数据库㊂将比对成功的r e a d s进行微生物分类注释,发现它们属于45个菌门㊁84个菌纲㊁186个菌目㊁418个菌科㊁1400个菌属和3467个菌种㊂2.2肠道微生物组成的空间差异2.2.1优势菌门丰度的空间差异通过宏基因组测序分析获得了十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠等各个肠段(图1A)的菌门水平的微生物累积丰度百分比,结果表明,各个肠段的门水平优势微生物均主要由厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等组成,但是不同菌门在不同肠段中的相对丰度存在着明显的差异,存在空间异质性(图1B)㊂十二指肠㊁回肠中拟杆菌门的累积相对丰度低于40%,然而盲肠中拟杆菌门的累积相对丰度为62.41%ʃ2.11%,极1331中 国 畜 牧 兽 医51卷显著高于其他3个肠段(P <0.01)㊂厚壁菌门累积相对丰度在不同肠段之间没有显著差异(P >0.05)㊂十二指肠㊁空肠㊁回肠样品中变形菌门的相对丰度显著高于盲肠(P <0.05),而盲肠中放线菌门的相对丰度极显著低于十二指肠㊁空肠和回肠(P <0.01)㊂另外在盲肠中注释到了相对丰度较高的螺旋体门,其物种累积百分比高于放线菌门㊂图1 肉鸭各肠段分布(A )及门水平优势微生物组成及丰度(B )F i g .1 D i s t r i b u t i o n (A )a n d c o m p o s i t i o na n da b u n d a n c e o f d o m i n a n tm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s a t t h e p h yl u ml e v e l (B )i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e gm e n t s o fm e a t d u c k s 2.2.2 门水平微生物种类差异 为了校正菌门水平的数据误差,本研究将菌门水平的注释得到的r e a d s 数进行对数转换,并统一测序深度,把对应结果作为菌门水平的相对丰度㊂其中盲肠注释到的菌门数极显著高于其他肠段(P <0.01),而十二指肠㊁空肠和回肠中的菌门数均无显著差异(P >0.05)(图2A ),其中芽单胞菌门㊁网团菌门等10个菌门仅在盲肠中分布(图2B ㊁2C )㊂结合菌门水平相对丰度热图结果发现,盲肠中除去拟杆菌门外,还有36个菌门的相对丰度高于十二指肠㊁空肠和回肠(图2C )㊂以上结果均证明盲肠门水平微生物种类和其他肠段之间存在着明显差异㊂2.2.3 优势菌属丰度的空间差异 在属水平上,优势菌属水平相对丰度和菌门水平具有相似的空间差异规律,不同肠段之间的微生物相对丰度也存在较大差异(图3),如拟杆菌属和P h o c a e i c o l a 属是各个肠段中累积丰度百分比最高的菌属,在所有样品中检出率达到100%,它们都隶属于拟杆菌门,但是在不同肠段之间存在着较大差异㊂其中盲肠中拟杆菌属和P h o c a e i c o l a 属的累积相对丰度分别达到13.80%ʃ0.61%和27.13%ʃ2.48%,极显著高于十二指肠㊁空肠和回肠(P <0.01)㊂而在十二指肠㊁空肠和回肠中,幽门螺杆菌属和棒状杆菌属的平均相对丰度则显著高于盲肠(P <0.01),尤其是幽门螺杆菌属平均丰度沿着肠道延伸还呈现出了逐渐降低的趋势㊂2.3 肠道微生物群落多样性差异本研究利用S h a n n o n 指数作为A l p h a 多样性的衡量标准㊂通过4个肠段的S h a n n o n 指数对比发现,随着肠段的延伸,十二指肠㊁空肠和回肠的微生物群落多样性呈现出逐渐升高的趋势,盲肠的微生物多样性极显著高于十二指肠㊁空肠和回肠(P <0.01,图4A )㊂P C o A 分析结果显示,样品明显按照不同取样肠段进行聚类,十二指肠㊁空肠㊁回肠3个肠段的微生物存在一定程度上的重合,而盲肠中微生物和3个肠段之间存在明显的分离(图4B ),证明盲肠微生物的群落构成和3个肠段微生物群落构成存在明显差异㊂23314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析A ,各肠段的菌门总数;B ,各肠段菌门分布的数目;C ,各肠段所有菌门相对丰度A ,T o t a l n u m b e r o fm i c r o b i a l p h y l a i n e a c h s e g m e n t o f t h e g u t s ;B ,D i s t r i b u t i o no fm i c r o b i a l p h y l a i n e a c h s e gm e n t o f t h e g u t s ;C ,R e l a t i v e a b u n d a n c e o f a l lm i c r o b i a l p h y l a i ne a c hs e g m e n t o f t h e g u t s 图2 各肠段菌门数及相对丰度统计F i g .2 C o u n t s a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e o fm i c r o b i a l p h y l a i nd i f f e r e n t s e gm e n t s o f t h e g u ts 图3 属水平优势微生物组成及丰度F i g .3 C o m p o s i t i o na n da b u n d a n c e o f d o m i n a n tm i c r o o r ga n i s m s a t t h e g e n u s l e v e l 3331中 国 畜 牧 兽 医51卷A ,各肠段微生物A l p h a 多样性分析结果;B ,各肠段微生物B e t a 多样性分析PC o A 结果A ,A l p h ad i v e r s i t y c o m p a r i s o na m o n g t h e g u t s e g m e n t s ;B ,P C o Ar e s u l t s o fB e t a -d i v e r s i t y c o m p a r i s o na m o n g t h e g u t s e g m e n t s 图4 各肠段微生物群落多样性分布图F i g .4 D i s t r i b u t i o no fm i c r o b i a l c o m m u n i t y d i v e r s i t y i n e a c h s e gm e n t o f g u t 本研究引入了A N O S I M 非参数统计方法来检验组间差异是否大于组内差异㊂结果表明,在菌属分类水平上,盲肠微生物群落和其他肠段的微生物群落之间存在显著差异,组间差异水平大于组内差异水平(R>0,P <0.01)㊂与此同时,P C A 分析结果同样表明,在科水平(图5A )和种水平(图5B )上,盲肠微生物群落多样性和其他肠段微生物的群落多样性存在明显差异,而十二指肠㊁空肠和回肠微生物群落多样性差异不显著,这与属水平微生物群落多样性存在相似的规律㊂图5 菌科水平(A )和种水平(B )的主成分分析图F i g .5 P C A p l o t a t f a m i l y (A )a n d s pe c i e s t a x o n o m i c l e v e l (B )2.4 肠道微生物功能多样性差异基于宏基因组K E G G 功能注释分析结果表明,盲肠和十二指肠(图6A )㊁空肠(图6B )㊁回肠(图6C )的微生物在功能注释水平存在显著差异㊂结合宏基因组K E G G 通路富集分析结果,发现与十二指肠㊁空肠和回肠微生物相比,盲肠微生物的细菌趋化性通路㊁核苷酸糖代谢通路,丙氨酸通路㊁天冬氨酸通路㊁非酒精性脂肪肝代谢通路㊁谷氨酸代谢通路和脂肪酸的生物合成通路等代谢通路均有上调趋势㊂43314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析图6 盲肠与十二指肠(A )㊁空肠(B )㊁回肠(C )微生物群落功能比较F i g .6 C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o fm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s b e t w e e n t h e c a e c u ma n d d u o d e n u m (A ),j e ju n u m (B ),i l e u m (C )i n t e r m s o f t h e i r f u n c t i o n s2.5 北京鸭和连城白鸭不同肠段微生物差异物种比较如图7所示,共筛选到了9个菌属的微生物在不同品系的十二指肠中差异分布,9个菌属的微生物在空肠中差异分布,4个菌属的微生物在回肠中差异分布,31个菌属的微生物在盲肠中差异分布㊂盲肠内北京鸭和连城白鸭的差异菌属数量超过十二指肠㊁空肠和回肠㊂图7 北京鸭和连城白鸭不同肠段的差异菌属F i g .7 T h e d i f f e r e n t i a l g e n e r a i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s o fP e k i nd u c ka n dL i a n c h e n g Wh i t e d u c k 5331中国畜牧兽医51卷3讨论肠道微生物群在宿主生长㊁免疫㊁代谢等方面发挥着重要作用,同时也是和宿主表型进行关联分析的重要参考指标㊂肉鸭的肠道微生物组成和猪[9,15-16]㊁人[9]㊁鸡[9,14,17-19]等物种具有一定的相似性,都主要包括细菌㊁古菌㊁真核微生物㊁病毒等㊂然而不同肠段的结构和功能存在较大差异,定植微生物的物种丰富度和群落多样性也存在较大差异,选择哪个肠段进行肠道微生物的差异分析研究就很有必要㊂本试验鉴定到的鸭各个肠段的门水平优势微生物均为厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等组成,与猪㊁鸡等物种的肠道微生物优势物种注释有着类似的结果[14-20]㊂本试验结果也进一步印证了远端肠道的盲肠中厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门的累积相对丰度和近端的3个肠段存在显著差异,尤其是盲肠中拟杆菌门的相对丰度极显著高于十二指肠㊁空肠和回肠㊂盲肠的相对封闭环境为微生物的繁殖提供了适宜的空间,而盲肠微生物大量繁殖为动物提供了许多其他方面的功能,如提高能量利用率,厌氧发酵产生短链脂肪酸(S C F A)等营养物质等[21]㊂作为优势菌属之一,拟杆菌以多糖作为主要的能量来源,参与碳水化合物的发酵㊁含氮物质的消化利用等[22],这也和在猪饲料中添加粗纤维的比例和饲养后盲肠内拟杆菌门的相对丰度呈现正相关[23]相互印证,而盲肠是消化粗纤维等大分子物质的主要场所,所以粗纤维中大分子物质的发酵可能是提高拟杆菌门相对丰度的重要因素㊂综上,本研究认为盲肠中的植物纤维素㊁木聚糖等物质由于消化不彻底,经过消化液的流动和小肠蠕动而向肠道末端移动,并大量积累于盲肠和结直肠区域,因此盲肠中的拟杆菌属等微生物由于能量来源充足而大量繁殖,使得盲肠中拟杆菌门的相对丰度极显著高于其他肠段㊂结合门水平微生物种类数差异和微生物群落A l p h a多样性中S h a n n o n指数分析发现,盲肠中微生物的物种丰富度和群落多样性极显著高于其他肠段㊂尽管肉鸭的肠道是连续的空腔,但是由于前肠中好氧细菌大量消耗氧气,使得后续肠段中厌氧微生物随着肠道的延伸而相对丰度不断升高,促进了厌氧微生物的积累[24]㊂其次,由于肠道的蠕动和消化液的流动,食糜在十二指肠㊁空肠和回肠中的储存时间显著短于盲肠[25],营养物质难以积累㊂且由于十二指肠㊁空肠和回肠中p H更接近于中性[26],导致胰蛋白酶㊁胰凝乳蛋白酶等消化酶在十二指肠㊁空肠和回肠中活性更高,使得在此部分肠道中酶促反应的速率极显著高于盲肠,加速了糖蛋白等大分子营养物质的分解,由于大分子营养物质在十二指肠㊁空肠和回肠中含量较低,使得十二指肠㊁空肠和回肠中缺乏足够的营养来源,进一步抑制了十二指肠㊁空肠和回肠内的发酵作用,导致了微生物的丰度得到了抑制[25,27]㊂肉鸭的盲肠具有盲端,食糜便于积累,不易扩散,这为微生物的培养和发酵提供了大量营养素,如黏蛋白㊁纤维素等,使得微生物由于营养素充足得以大量繁殖,宏基因组功能注释结果中盲肠微生物的细菌趋化性强也印证了这个问题㊂综上所述,氧气浓度差异和营养素积累差异,可能是影响各个肠段微生物分布的重要因素,也是使得盲肠微生物的菌门数㊁微生物相对丰度和群落多样性极显著高于其他3个肠段的可能原因㊂通过以门水平的B r a y-C u r t i s距离矩阵为指标的B e t a多样性分析,本研究发现十二指肠㊁空肠和回肠的差异不显著,而盲肠和3个肠段具有明显的分离㊂而I s a a c s o n等[22]也发现了盲肠和结直肠与其他各个肠段存在着明显的分离㊂而盲肠中微生物以厌氧菌为主,这也充分印证了氧气含量[28]和养分[29-30]是影响微生物分布的重要因素㊂北京鸭和连城白鸭在体格大小㊁料重比㊁采食量等生长指标均存在着较大差异,这可能与肠道微生物有密切关系㊂本研究发现北京鸭和连城白鸭盲肠内的差异菌属数量超过十二指肠㊁空肠和回肠,且差异菌属,如R o t h i a(罗氏菌属)等和脂肪代谢㊁消化吸收等作用有关㊂综上所述,盲肠微生物的种类㊁丰度㊁群落多样性均显著高于其他各个肠段,发现盲肠的环境更适合微生物的繁殖,所以盲肠是研究肉鸭肠道微生物的重要肠段,这为之后肉鸭肠道微生物的深入研究提供了充分的借鉴价值㊂4结论本研究发现肉鸭肠道微生物的分布存在明显的空间异质性㊂各肠段优势菌门的种类相同,然而相对丰度却存在明显差异㊂十二指肠㊁空肠㊁回肠段的微生物种类和相对丰度差异不显著,而盲肠的微生物群落多样性和物种丰富度极显著高于其他肠段,北京鸭和连城白鸭的盲肠差异菌属数也高于十二指肠㊁空肠和回肠,并且筛选到了盲肠微生物和十二指肠㊁空肠和回肠微生物的差异代谢通路㊂63314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析参考文献(R e f e r e n c e s):[1]孙永波,王亚,萨仁娜,等.家禽肠道健康评价指标研究进展[J].动物营养学报,2017,29(12):4266-4272.S U N Y B,WA N G Y,S A R N,e t a l.R e s e a r c hp r o g r e s so ne v a l u a t i o ni n d i c a t o r so f i n t e s t i n a lh e a l t hi n p o u l t r y[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a lN u t r i t i o n,2017,29(12):4266-4272.(i nC h i n e s e)[2]王晶,许丽,齐广海,等.家禽肠道健康及其营养调控措施[J].动物营养学报,2019,31(6):2479-2486.WA N GJ,X U L,Q IG H,e t a l.I n t e s t i n a l h e a l t ha n di t s n u t r i t i o n a l m o d u l a t i o n m e a s u r e s o f p o u l t r y[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a lN u t r i t i o n,2019,31(6):2479-2486.(i nC h i n e s e)[3] D A U D E L 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