实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
姓名孙镭系年级2010级组别齐鲁医学班同组者孙义远科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离，纯化学号201000232117【实验目的】1. 通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法2. 熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光【实验原理】1.叶绿体分离的原理：匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
2.差速离心特点：介质密度均一速度由高到低，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器沉降顺序：核----线粒体------溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体------核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3.荧光的概念：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。
紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。
一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。
某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。
实验一密度梯度离心法提取叶绿体［实验项目］密度梯度离心法提取叶绿体［实验目的］掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
［实验原理］不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。
用不同浓度的蔗糖制成浓度梯度，在离心条件下，叶绿体和比他沉降系数小的细胞组分会聚集中到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分则沉淀到离心管底部，这样可粗略的分离叶绿体。
［实验仪器设备］超速冷冻离心机（BECKMAN L8-60MF一台荧光显微镜（（Olympus，FX-35WA Japan））一台组织捣碎机一台［实验材料］新鲜菠菜叶片［实验药品］匀浆介质（0.25mol/L 蔗糖，0.05mol/L Tris-HCI 缓冲液pH 7.4）;称取88.55g 蔗糖，6.05g Tris ，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约 4.25ml 0.1mol/L HCl ，最后定容至1000ml。
60沁糖溶液，50沁糖溶液，40沁糖溶液，20沁糖溶液，15%^糖溶液。
［实验内容］1、洗净菠菜叶片，沥干水分，去除叶柄、主脉，称取50g，剪碎。
2、加入预冷到0C的匀浆介质200ml，用组织捣碎机高档捣碎2min。
3、捣碎液双层纱布过滤到烧杯中。
4、滤液500r/min离心5min，轻取上清液。
5、在Polyallomer离心管内一次加入50%和15%^糖溶液（或依次加入60%40% 20% 15%^糖溶液），注意要用滴管吸取15%^糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50沁糖液面，一般两种溶液各加12ml(四个梯度各加6ml), 加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍有不同，这样密度梯度便制好了。
&在制好的密度梯度上小心的沿着管壁加入3ml粗离心过的上清液。
7、严格平衡离心管，分量不足加入少许上清液。
8、用甩平转头离心(18000r/min ) 90min。
