犊牛腹泻的诊断与治疗

犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验

犊牛腹泻是指肠蠕动亢进，肠内吸收不全或吸收困难，致使肠内容物与多量水分被排出体外的一种犊牛疾病。其临床特征是拉稀便、软便或水样便，呕吐，脱水，体重减轻和酸中毒，死亡较快。本病一年四季均可发生，尤其以夏末秋初多发，其中3周龄以内的新生犊牛发病率和死亡率最高，被称为新生犊牛的杀手。所以哺乳期犊牛的饲养管理是奶牛生产中的一个重要阶段，如果此时由于营养缺乏或管理不善，则不仅直接给奶牛场造成巨大的经济损失，而且也影响到犊牛的生长发育和成年后的泌乳性能。可以说，犊牛腹泻是影响犊牛健康生长的最主要的疾病之一。因此，如何预防犊牛腹泻就成了重中之重。它分为营养性（如由牛奶饲喂过量，牛奶突然改变成分，低质代乳品，奶温过低等引起）和传染性(如由细菌、病毒、寄生虫等引起)腹泻两种。但是，这一分类是人为的，生产实践中往往是由于营养性腹泻或饲养管理不当而使犊牛更易患传染性腹泻。大肠杆菌是引起新生犊牛腹泻的主要病原菌。

2012年4月，山东潍坊某牛场半开放式圈舍中饲养的10日龄以上23头犊牛中11头犊牛陆续发生腹泻，粪便稀薄，有臭味，有黄白色便、带血丝便、泡沫样便。病牛10日龄之前一律先在一普通民房中饲养，10日龄以后被转移至带有运动场的半开放式圈舍中，自从被转移过来以后，陆续有牛发生腹泻。兽医曾用头孢类和磺胺类抗菌药物治疗，未见明显显效，已数头犊牛死亡。

1． 材料与方法

1.1材料

1.1.1 病料 采自山东省潍坊某奶牛场腹泻病死犊牛采取粪样、肝、肠、脾等脏器病料。

1.1.2 试验动物 昆明系小鼠 ,购于潍坊医学院实验动物中心。3日龄乳鼠购于潍坊医学院实验动物中心。

1.2方法

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养及形态学鉴定 将采集的腹泻粪样按常规方法接种于麦糠凯培养基、伊红美蓝培养基和血琼脂培养基上,37℃培养24 h,观察在平板上的生长情况。以无菌接种环分别挑取麦糠凯和伊红美蓝培养基上的单个菌落,接种普通琼脂斜面,37℃纯培养24 h,对纯培养物涂片,革兰染色,镜检及荚膜、芽孢染色镜检。

1.2.2 分离菌的生化试验 挑取纯培养物接种于三糖铁琼脂、糖微量发酵管(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇)、尿素分解管、赖氨酸、苯丙氨酸生化管、磷酸盐葡萄糖胨水、硫化氢、靛基质反应管、硝酸盐还原管、构椽酸盐管,甲基红(MR)试验、VP试验等,37℃培养24 h~72 h,观察并记录结果[9]。

1.2.3 分离菌的血清型鉴定 将纯培养的待检菌液接种于普通琼脂平板,37℃培养24 h,用5 g/L的石炭酸生理盐水将菌苔洗下,制成浓稠的悬液,经121e、2 h高压灭菌破坏K抗原,冷却后取等量的菌悬液与大肠埃希菌O抗原定型血清在玻璃板上混匀,半分钟内出现凝集者为阳性,同时设生理盐水对照[10-11]。

1.2.4 分离菌的致病性检测 随机挑取麦康凯上纯培养的菌落,接种于营养肉汤中,取24 h内培养物,备用。取健康小鼠20只,随机分为试验组和对照组,每组10只。将上述制备的待测菌液腹腔接种于试验组小鼠,0.4 mL/只;对照组小鼠注射等量生理盐水,观察72 h。剖检死亡小鼠,无菌采集心脏和肝脏,涂片、镜检。同时抽取少量腹水在伊红美兰培养基上均匀涂抹,37肝脏,涂片、镜检。同时抽取少量腹水在伊红美兰培养基上均匀涂抹,37e培养18 h~24 h后,观察结果[12]。

1.2.6 分离菌的药物敏感性试验 按世界卫生组织(WHO)推荐的Kirby-Barer法进行,在普通营养琼脂平皿上挑取2个形态上相似、直径1 mm左右的菌落接种于3 mL肉汤中,37e培养16 h,用无菌棉拭子蘸取菌液涂布琼脂平板表面(可重复来回划线),待稍干后,用无菌镊子将各种定量浓度抗菌药圆纸片分别贴于培养基表面,各片距离要相等,37e培养24 h观察结果。根据药物纸片有无抑菌圈及其大小来判断该菌对各种药物的敏感程度。用

质控标准菌株大肠埃希菌ATCC25922控制试验的精确度和准确度。根据NCCLS提供的标准(表1)判定药敏结果。

表1 药敏纸片的种类及判定标准

Z嚅1 Category and criteria of antibiotic resistance slip

药物

Antibiotics

纸片药物含量/(Lg#片-1)

Drug contents

抑菌圈直径/mm Diameter of antimicrobial circle

耐药 Resistance中敏 Midst ensitivity敏感 Sensitivity

氯霉素Chloramphenicol 30[12 13~17\18

链霉素Streptomycin 10[11 12~14\15

红霉素Erythromycin 15[13 14~17\18

四环素Tetracycline 30[14 15~18\19

庆大霉素Gentamicin 10[12 13~14\15

氟哌酸Norfloxacin 10[15 16~20\21

卡那霉素Kanamycin 30[13 14~17\18

丁胺卡那霉素Amikacin 30[14 15~16\17

氨苄青霉素Ampicillin 10[13 14~16\17

多黏菌素B Polymycin B 5[16 17~19\20

2 结果

2.1 分离菌的培养特性及形态特征

分离菌在麦糠凯培养基中形成中等大小、表面

光滑湿润的粉红色菌落;在伊红美兰培养基上形成

带有金属闪光的紫黑色小菌落;在血琼脂平板上形

成B-溶血。营养肉汤呈均匀浑浊,底部有黏性沉淀。

细菌涂片革兰染色为阴性,两端钝圆的短杆菌,大多

单个存在,有的成对存在,不形成芽孢和荚膜。结果

表明,从犊牛的腹泻粪便中分离得到的细菌的培养

特性和形态特征,基本符合大肠埃希菌生化特性,可

初步判定其为大肠埃希菌。

2.2 分离菌的生化特性 分离菌生化特性试验结果见表2。

表2 分离菌株的生化特性

Table 2 Biochemical characteristics of the isolates

项目

Item

结果

Results

项目

Item

结果

Results

三糖铁Triple sugar iron agarÝ苯丙氨酸Phenylalanine -

葡萄糖GlucoseÝ磷酸盐葡萄糖胨水Phosphate glucose peptone waterÝ

乳糖LactoseÝ硫化氢H2S -

麦芽糖MaltoseÝ靛基质Indole +

蔗糖Sucrose -硝酸盐还原Nitrate reduction +

甘露醇MannitolÝ枸橼酸盐Citrate -

尿素Carbamide -甲基红MR +

赖氨酸LysineÝV-P -

注:/Ý0表示产酸产气;/+0表示产酸或阳性反应;/)0阴性反应。

Note:/Ý0means acidic and aeroginous reaction;/+0means acidic or

positive reaction;/-0means negative reaction.

从分离菌的生化特性、结合培养特性和形态特

征,判断分离菌为大肠埃希菌。

2.3 血清型鉴定结果

将分离的大肠埃希菌与标准血清进行凝集反

应,分离菌只与O9因子的血清出现凝集反应,表明

该株大肠埃希菌的血清型为O9,为犊牛腹泻型大肠

埃希菌。

2.4 分离菌的致病性检测结果

试验小鼠接种后8 h左右出现腹泻症状,发病

率为100%。发病后小鼠精神沉郁,倦怠,饮食量减

少甚至不饮食,有的被毛逆立,腹式呼吸,80%的小

鼠肛门周围及尾部粘有黄色稀便。28 h出现死亡,

至试验末共死亡6只,死亡率为60%。无菌采集死

亡小鼠心脏和肝脏,涂片、染色、镜检,镜下可见革兰

染色阴性的杆菌。接种腹水的营养琼脂培养基上,

生长的菌落形态基本符合大肠埃希菌的形态特征。

空白对照组正常。说明从腹泻犊牛的粪便中分离的

大肠埃希菌为致病性大肠埃希菌。

2.5 分离菌的肠毒素检测结果

用乳鼠胃内注射法测定肠毒素,其肠重与剩余

尸体重的比率为0.09,结果为阳性。该菌株能产生

热稳定肠毒素。 2.6 分离菌的耐药性检测结果

分离菌耐药性检测结果见表3。

表3 大肠埃希菌耐药性检测结果

Table 3 Results of drug resistance test ofE.coli

药物

Drugs

耐药

Resistance

中度敏感

Midst sensitivity

敏感

Sensitivity

氯霉素Chloramphenicol - + -

链霉素Streptomycin + - -

红霉素Erythromycin + - -

四环素Tetracycline + - -

庆大霉素Gentamicin + - -

氟哌酸Norfloxaci - + -

卡那霉素Kanamycin - + -

丁胺卡那霉素Amikacin - - +

氨苄青霉素Ampicillin + - -

多黏菌素B Polymycin B - - +

注:/+0表示阳性结果,/)0表示阴性结果

Note:/+0means acidic or positive reaction;/-0means negative

reaction.

分离菌对多黏菌素、丁胺卡那霉素敏感,氯霉

素、氟哌酸、卡那霉素中度敏感,对链霉素、红霉素、

四环素、庆大霉素和氨苄青霉素则表现出耐药性。

3 讨论

犊牛大肠埃希菌性腹泻是犊牛最常见的疾病一,多在5日龄内发病,呈急性经过,主要症状是腹泻、脱水和衰弱。病初腹胀,排水样、黄白色或绿色

粪便,发病后1至数日内死亡[9]。当圈舍的卫生过差,通风不良,过于潮湿时,可降低犊牛机体的抵抗力,促进本病的发生。本试验从腹泻犊牛采取病料进行病原的分离鉴定,分离菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠埃希菌基本一致,鉴定为大肠埃希菌,表明该奶牛场犊牛腹泻的病原菌主要是大肠埃希菌。本研究分离的菌株经O抗原血清鉴定为大肠埃希菌O9型,该菌株能产生热稳定肠毒素,为犊牛腹泻型大肠埃希菌。肠致病性大肠埃希菌首先是依靠纤毛抗原粘着于小肠黏膜的上皮细胞上,然后大量繁殖,并产生肠毒素。肠毒素吸收入血后引起毒血症或急性腹泻。消化道是肠毒素型大肠埃希菌侵入机体的主要途径,它通过菌体表面的一种对宿主特异性的黏附因子黏附到宿主小肠黏膜表面并繁殖,分泌肠毒素,引起肠黏膜细胞水肿与电解质代谢紊乱,导致腹泻[14-15]。

大肠埃希菌容易形成抗药性,且可通过菌毛将其抗药性质粒进行传递[12]。药敏试验结果表明该分离菌对多黏菌素、丁胺卡那霉素敏感,对氟哌酸、卡