当前位置：文档之家 › lipofectamine3000-说明书

lipofectamine3000-说明书

  • 格式：doc
  • 大小：27.00 KB
  • 文档页数：1

lipofectamine3000 protocol 中文版

1.接种细胞至70-90%汇合度时转染

2.使用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine®3000试剂(2管)，充分混匀

3. 使用Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加P3000™试剂，充分混匀。

4. 在每管已稀释的Lipofectamine®3000试剂中加入稀释的DNA (1:1比例)。

5. 室温孵育5分钟。

6. 加入DNA-脂质体复合物至细胞中。

7. 37℃孵育细胞2 - 4天。然后分析转染细胞。

siRNA转染

转染siRNA至细胞中时，遵循如上所述的DNA实验方案，但在稀释siRNA时不要

加入P3000™试剂(第3步)。

`

表1：使用lipofectamine®3000转染 DNA产品参考用量

细胞培养容器 96-well 24-well 6-well

贴壁细胞 1–4 × 104 –2 × 105 –1 × 106

;

Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine®3000试剂（2管） Opti-MEM培养基 5 μL × 2 25 μL × 2 125 μL × 2

Lipofectamine®3000 和 μL 和 μL 和 μL

Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加P3000™试剂，充分混匀 :

Opti-MEM培养基 10 μL 50 μL 250 μL

DNA –5 μg/μL) μg 1 μg 5 μg

P3000™ 试剂(2

μL/μg DNA) 、

μL 2 μL 10 μL

Lipofectamine®3000试剂中加入稀释的DNA (1:1比例) 稀释的DNA 5 μL 25 μL 125 μL

稀释的Lipofectamine® 3000 5 μL [

25 μL 125 μL

室温孵育5分钟

加入DNA-脂质体复合物至细胞中 96-well 24-well 6-well

DNA-脂质体复合物 10 μL 50 μL 250 μL

37°C孵育细胞2–4天。然后分析转染细胞。

合集下载

LncRNA_FGD5-AS1靶向miR-16-5p

LncRNA_FGD5-AS1靶向miR-16-5p

LncRNAFGD5-AS1靶向miR-16-5p/CREB1轴

减轻缺氧/复氧诱导大鼠H9c2心肌细胞凋亡的

机制研究

谢小芳,赵展庆,符妹垂

摘要 目的:探究长链非编码RNA(LncRNA)FGD5反义RNA1(FGD5-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡的影

响以及对微小RNA-16-5p/cAMP响应元件结合蛋白1(miR-16-5p/CREB1)轴的调节机制。方法:将H9c2细胞分为对照组和H/R组(缺氧6h,复氧6h),然后将H/R组细胞分别进行转染,分为oe-NC组、oe-FGD5-AS1组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5pmimic-NC组、

oe-FGD5-AS1+miR-16-5pmimic组。实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法(RT-qPCR)检测细胞中FGD5-AS1、miR-16-5p、

CREB1的mRNA水平;蛋白免疫印迹(WesternBlot)法测定裂解凋亡蛋白酶-3(cleavedCaspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)

和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;CCK-8法测定细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶活性实验分别验证miR-16-5p

和FGD5-AS1、CREB1的靶向关系。结果:与对照组比较,H/R组细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋

白表达降低(P<0.05),miR-16-5pmRNA水平、细胞凋亡率及cleavedCaspase-3、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与H/R组和oe-NC

组比较,转染过表达FGD5-AS1基因的H9c2细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达增高,凋亡率

及miR-16-5p、cleavedCaspase-3、Bax水平下降(P<0.05)。双荧光素酶活性实验验证了FGD5-AS1、CREB1均与miR-16-5p有结

Invitrogen_Lipofectamine2000

Invitrogen_Lipofectamine2000

Lipofectamine™ 2000

前言

Lipofectamine™ 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth™ RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™

RNA或者siRNAj进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。

影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素

在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括：

·转染效率

·目的基因转录效率

·蛋白质稳定性

·所选择特异StealthTMRNA或者siRNA序列的效率

·所选择哺乳动物细胞系的生长特征

当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。

转染的一般性指导

使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：

1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth™ RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™ 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth™

RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth™ RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth™ RNA或者siRNA。

2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。

Lipofectamine_2000转染说明

Lipofectamine_2000转染说明

LipofectamineTM 2000

CAT. NO. 11668-027 Size: 0.75ml

CAT. NO. 11668-019 Size: 1.5 ml

4℃储存（不要冻存）

说明：

LipofectaminTM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：

 对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在 的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。

 在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- LipofectaminTM 2000复合物能够直接加给细胞。

 在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。

关于转染的一些重要建议：

1. 不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在/rnai上有转染步骤，登陆后点击说明。

2. 对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与LipofectamineTM 2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985-062）（reduced serum medium）稀释LipofectamineTM 2000和DNA.

3. 为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条件。

4. 为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。、

5. 由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和LipofectamineTM 2000的相容性。

Lipofectamine_LTX_转染步骤

Lipofectamine_LTX_转染步骤

Lipofectamine™ LTX Reagent Cat. No. 15338-100 Size: 1.0 ml

Store at +4°C (do not freeze)

Description

Lipofectamine™ LTX Reagent is a proprietary, animal-origin free formulation for

the transfection of DNA into eukaryotic cells offering the following advantages:

• Highest transfection expression performance with low cytotoxicity in many

cell types and formats (e.g. 96 well).

• Easy One-Tube protocol for complex formation of Lipofectamine

™ LTX

Reagent with DNA.

• Reduced cytotoxicity of Lipofectamine™ LTX Reagent allows for use of a

greater range of lipid doses, allowing excellent transfection results despite

differences in cell density, minor pipetting inaccuracies, and other variations.

Important Guidelines for Transfection

• We recommend the One Tube Protocol (page 2) for most applications. For

high-throughput experiments, or if you dispense small amounts of