cm215fw加载体方法

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表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选.

质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载

体）；

（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；

（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。

以下所有实验，进行前请认真阅读试剂使用说明书。

一．RNA反转录cDNA

试剂盒：Takara PrimeScript® RT reagent Kit

操作步骤：

提前调水浴锅至42℃；

按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。

5×PrimeScript® Buffer(for Real Time) 2 μl

PrimeScript® RT Enzyme Mix I 0.5 μl

Oligo dT Primer(50 μM) 0.5 μl

Random 6 mers(100 μM) 0.5 μl

Total RNA 360ng

RNase Free dH2O up to 10 μl

total 10μl

轻柔吹打均匀；

室温放置10min；

42℃水浴锅中放置1h；

冰中冷却2min；

上述反应可根据条件在PCR仪中进行。

当需要使用的基因编码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将 RNA 溶液于 65°C加热 5 分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。

二．目的基因扩增引物设计原则：

a) 特异性：在cDNA中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast检验）

b) 在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基；

c) 酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使用平末端位点；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用primer premier对序列中的酶切位点进行分析。

三．PCR反应：

拿到新合成的引物后，一般会设置退火温度梯度，摸索最适退火温度。（Tm-5）℃不是一个普适的规律，最好不要太依赖。

4k以下的片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作即可；

美能达283进入维修模式的方法是：效用，详情，停00停01

美能达283硒鼓清零： 清OPC计数找着计数器这一项counter

美能达283载体初如化：

成像处理调整下面的TCR传感器调整

美能达283修改及设置密码

密码选项设置在安全模式下，安全模式进入的方法是先进入维修模式，然后再按停0C 找到CE PASSWORD下面设置为开，默认密码92729272

“效用/计数器”→详细资料→停00停01→8个“0” →END 错误代码：

C2557错误：（墨粉浓度高）更换载体把T粉瓶取出，启动后按“效用”，输入“停00停01”此时会出现一个密码输入框，输入“00000000（默认密码）”按“END”进入，选取第一项Tech.Rep choice → Printer →ATDC SconsorGain(一般默认是150-160)记下你看到的数值，按C 输入新的数值，一般10个点子的加（例：看到的是“136”，可以试一下输入130、120、110、100、140、150、160、170 180等），输入后退出，让后重新启动复印机，把ATDC值调到180或190，暴几十张黑版，如果正常则解决，否则还的重新设定该值。

处理方法2:打开右边接口处左边的盖子里面有一个很小的按钮,按一下,此时复印机会重新启动,在启动时出现美能达标志时看到一个小的方块时同时按下3,这时会出现一个输入框,在里面输入8位数的密码(一般是00000000),时入后选择复位一项确认后此时复印机会重新启动,一般情况就可以解决此问题。

处理方法3:可能是临时故障,也有可能是显影组建里没有载体引起来的,如加了载体请先进行复印机清零,然后做F8 (要先把粉取出来)

复印机重动后安效用键，此时打开计数器，查看详细资料,输入"停00停01"此时会出现一个密码输入框,输入"00000000(默认)"按"END"进入维修模式,选取左边第三项"Funtion",进入选项，选择F8，进入后屏幕显示空白，此时按复印键，复印机会自动检测载休，并对载体的参数做自动设定，约3分钟后运转停止，按END或EXIT退出，重新启动复印机即可。

(WORD)-生产企业质量管理制度范本760

1 慢病毒（过表达）包装步骤

秦超

1. 转染

复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）

⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀

⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min

⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min

⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2. 收毒(36-48h)

收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。

⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3. 接毒

接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml

细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。

4. 检测及培养细胞系(48h)

如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。 青山埋白骨，绿水吊忠魂。