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提取纯化制备竹叶黄酮的研究作者：曹亚兰罗艳萍罗锦杰来源：《现代食品·下》2019年第03期摘要：目的：制备符合新资源食品要求的竹叶黄酮。
方法：将竹叶先进行优化提取，得到粗制竹叶黄酮，再经大孔吸附树脂柱纯化，得到符合新资源食品要求的竹叶黄酮。
结论：竹叶经水提工艺得到的总黄酮总量为9.72%;乙醇提取工艺的总量为12.65%;水提醇沉工艺的总量为16.03%;水提或醇提工艺后，再经大孔吸附树脂柱后总量为24.13%或29.57%，均达到新资源食品要求。
关键词：竹叶黄酮;提取;纯化中图分类号：TQ914.1竹叶是卫生部确定的药食两用的天然植物，是一种资源丰富且廉价的林业资源。
但相关研究较少，对其的开发利用相对较滞后，这无疑是对自然资源的严重浪费。
研究发现，竹叶中含有大量的活性成分，如黄酮及其苷类、活性多糖、特种氨基酸及其肽类、微量元素及芳香成分等”。
其中黄酮类物质是一类重要的抗氧化剂，具有抗氧化、抗疲劳、抑菌、降血脂与增强免疫力等多种生理功能。
本研究从安全性、经济效益、大规模产业化等方面考虑，研究楠竹竹叶的提取工艺及纯化方案，以期得到符合新资源食品要求的竹叶黄酮，同时为充分利用竹子加工业的副产品，开发利用竹叶资源，提高产品的附加值，实现产业化提供科学依据。
1材料与仪器1.1材料与试剂新鲜的楠竹竹叶，采自四川长宁，将楠竹竹叶晾晒，于60C左右烘干，适度粉碎后，装入塑料袋中密封，干燥贮存备用。
芦丁标准品（纯度为92.6%，批号：100080-201409），购于广东省药品检验所;AB-8大孔吸附树脂，购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司;甲醇、氢氧化钠、乙醚、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯。
1.2试验仪器UV-2450型紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司;DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;118B摇摆式八两装高速中药粉碎机：浙江温州瑞安市永历制药机械有限公司;ABT220-5DM十万分之一天平：广州得翔科技有限公司;AUY120EXP岛津万分之一天平：日本岛津;RE-3000旋转蒸发器：上海亚荣生化儀器厂;SHB-II型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。
竹叶黄酮的提取工艺研究进展曹婧;侯春久【摘要】Flavonoids are widely found in nature.Bamboo leaves contain abundant flavonoids, this kind of material has high edible and medicinal value.It can be further processed into health food, medicine, cosmetics and food additives, etc.So flavonoids compounds are becoming a research hotspot in recent years.The extraction technology of bamboo leaves flavonoids and research progress of new technology were mainly summarized, to provide a reference for the further research of the bamboo leaves flavonoids, such as purification, determination.%黄酮类化合物广泛存在于自然界中,而竹叶中含有丰富的黄酮类化合物,该类物质有较高的食用和药用价值,可进一步加工成保健食品、药品、化妆品和食品添加剂等.因此竹叶黄酮类化合物已经成为近年来的研究热点,本文主要综述了竹叶黄酮类化合物的各种提取工艺方法和新技术的研究进展,为竹叶黄酮类化合物的纯化、含量测定等后期研究提供一定的参考.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2017(045)010【总页数】3页(P18-19,42)【关键词】竹叶;竹叶黄酮;提取【作者】曹婧;侯春久【作者单位】江西中医药高等专科学校,江西抚州 344000;江西中医药高等专科学校,江西抚州 344000【正文语种】中文【中图分类】TQ914.1竹子广泛分布在热带、亚热带，而我国是竹子分布的中心地区，竹叶在我国已有悠久的药食两用历史，具有相当好的使用价值，日益受到人们的重视，是当今世界上最有价值的天然植物之一，研究发现竹叶中含有黄酮类化合物和其他生物活性成份，如蒽醌类、香豆素类内酯、活性多糖、酚类、特种氨基酸等，其中以黄酮类化合物为主。
湘西慈竹叶中黄酮的提取与测定蒋剑波;周志刚;彭丁栋【摘要】设计正交试验,以溶剂浸提-回流法提取,以分光光度法测定,研究了湘西慈竹叶中总黄酮提取和测定的方法.结果表明:溶剂、溶剂浓度、水浴温度、回流时间4种因素对提取效果影响大小依次为,溶剂>溶剂浓度>回流时间>水浴温度,其中溶剂及其浓度是主要因素,回流时间和水浴温度是次要因素.不同溶剂对慈竹叶总黄酮提取效果影响大小顺序为丙酮>乙醇>乙醚.浸提一回流法提取湘西慈竹叶中黄酮类化舍物的优化提取条件(固定料液比为1:20)是:以75%的丙酮为浸提剂,于70℃下回流加热4 h.在优化提取条件下,测得湘西慈竹叶总黄酮含量为13.0 mg·g-1(春)～12.4 mg·g-1(秋),春季新叶中黄酮含量略高于秋季老叶.湘西慈竹叶总黄酮含量略低于四川南充慈竹叶.【期刊名称】《中国野生植物资源》【年(卷),期】2011(030)002【总页数】5页(P46-50)【关键词】湘西慈竹;天然黄酮;浸提-回流法;正交试验【作者】蒋剑波;周志刚;彭丁栋【作者单位】吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000;中南大学化学化工学院,湖南长沙410083;吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000;吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000【正文语种】中文【中图分类】O657.7;O658黄酮类化合物 (flavonoid)又称黄酮体、黄碱素,是一类以 C6-C3-C6碳架为基本特征的低相对分子质量多酚化合物,广泛存在于自然界中,尤其是在植物界中分布最广。
研究表明,黄酮类化合物具有多种生物活性,尤其是其在临床上治疗心血管疾病的强心、扩张冠状血管、增加冠脉血流量、抗心律失常、降压、降低血胆固醇等作用[1]被发现以来,在国内外掀起了从各种植物中寻找和提取天然黄酮的热潮。
20世纪 90年代以来,人们对竹叶的研究发现[2],竹叶提取物 (Ebl)具有良好的抗衰老、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效。
竹叶黄酮的分离提取、检测与成分分析 姓名：周胤潇 班级:微生物121 学号：201201220414 摘要：竹叶黄酮(Bamboo- leaf-flavonoid, BLF)是我们于上世纪90年代末创制的一种新型植物黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、扩冠和免疫增强活性等（1-2）。竹叶总黄酮以其巨大的资源优势和良好的药理活性将成为一种非常有前途的天然药物,具有广阔的开发前景.本实验主要对竹叶中黄酮类物质的含量用紫外分光法进行测定以及高效液相色谱法对竹叶提取物的成分分析。 关键词：竹叶 黄酮类物质 紫外分光法 高效液相色谱法 前言 竹子为禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物，在我国分布很广，资源十分丰富。竹子在建筑、水利、农业等领域都有广泛的应用，然而，竹子加工利用后，竹叶却总是被弃置，造成了极大浪费。近年来的研究发现竹叶中含有多种活性物质，其主要活性物质是黄酮类物质,含量平均在2%,竹叶提取物中的有效成分主要是以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷为代表的碳苷黄酮和以对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸为代表的植物酚酸为主，竹叶黄酮中的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素内酯,黄酮类物质是一类天然植物成分，具有显著的生理及药理活性，黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用⑶。
实验目的： （1）掌握样品的前处理的方法 （2）掌握竹叶黄酮的提取、分离与纯化 （3）用 硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定竹叶子中总黄酮 （4）采用超高效液相色谱（UPLC）定量分析竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡 荆苷、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸 8 个特征性成分的量。 1 实验材料和仪器
1.1实验材料： 竹叶（摘自浙江农林大学校园内）
标准样品：甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚（分析纯）、氢氧化钠、芦丁标准品（购自中国药品生物制品检定所，纯度均大于98%）、去离子水。 芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥至恒重的芦丁对照品5.600mg，加入甲醇溶液定容至50mL，配成112ug/mL的芦丁标准溶液。 5%亚硝酸钠溶液：称取约5.263g亚硝酸钠溶解在100mL去离子水，置于4℃冰箱中备用。 10%硝酸铝溶液：称取约11.111g硝酸铝溶于100mL去离子水中，置于4℃冰箱中备用 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.000g氢氧化钠溶于100mL去离子水中，置于4℃冰箱备用。 1.2实验仪器：
40目筛 高速冷冻离心机、 旋转蒸发仪、 紫外分光光度计、 微波炉、 粉碎机、 回流装置 密封袋 ACQUITY™ Ultra Performance LC超高效液相色谱系统，包含二元溶剂管理器，样品管理器，柱温箱和二阵管阵列检测器； Micromass Q-Tof micro TM 串联质谱（美国Waters公司） 2 实验原理及方法
2.1 实验原理： 浸提、洗脱原理： 根据相似相溶原理，对所用溶剂按黄酮类化合物的极性来选择，竹叶中所含的有效活性物质主要为黄酮甙类，具有较大的极性和亲水性，故可以选择热水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行浸提。但由于水的极性过大，且易于将蛋白质、糖类的易溶于水的成分浸提出来，且水提法提取物存放易发霉，从而影响黄酮类化合物的提取和分离。故本实验选用甲醇水溶液作为浸提及洗脱溶剂⑷。 2.2工艺流程（5，6，7） 新鲜竹叶→洗净烘干→ 破碎 →过筛（40目）→ 回流浸提 →抽滤→悬蒸→定容→测定吸光度→ 分析计算 2.3实验步骤
2.3.1 竹叶处理
采集竹叶，，立刻用微波炉进行杀青干燥（微波炉，700W，间隙加热2~3次，每次60S），将烘干的竹样用粉碎机粉碎，过40目筛，将滤过的竹样粉末放入密封袋中密封，放置于-40℃冰箱中储存备用。 2.3.2 竹叶黄酮的提取与纯化 2.3.2.1 竹叶黄酮的提取 1.精确称取竹样粉末各200.00g。 2.加入150mL60%乙醇-水溶液，浸泡30min。 3.水浴锅水温75℃热回流提取1h。 4.冷却至室温，过滤，收集滤液。 5.在滤渣中加入50mL60%乙醇进行二次回流30min。 6.冷却至室温收集滤液，弃滤渣，密封，标号，置于4℃冰箱，备用。
2..3.2.2萃取、纯化 在竹样粗提取液中加入100mL石油醚进行萃取脱脂脱叶绿素，弃上清液取下沉液，再次加入100mL石油醚进行萃取，重复2次，将提取液密封保存至4℃冰箱备用。 2.3 .2.3 浓缩干燥 将萃取过的竹叶提取液用旋转蒸发仪将其浓缩干燥，将干燥后的残渣（黄酮初提物）用60%甲醇定容至100mL容量瓶中，保存于4℃冰箱备用。 2.42.3.4 离心 将竹叶黄酮浓缩液用离心机在转速为4000rpm，温度10℃条件下离心10min，取上清液，保存至4℃冰箱备用。 2.3.3 黄酮总含量测定----硝酸铝-亚硝酸钠比色法 标准曲线制作：精确称取经105℃干燥至恒重的芦丁标准品5.600mg，加入甲醇溶液并定容至50mL，配成112ug/mL的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1、2、3、4mL移入10mL具塞试管中，用60%甲醇定容至5mL，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，再加入10%硝酸铝溶液0.3mL振摇后放置6min，再加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用60%甲醇定容至10mL，静置10min，以零管为空白，摇匀后在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、芦丁的微克数为横坐标绘制标准曲线以及求取线性回归方程。 样品黄酮含量测定： 1. 取竹样黄酮提取液400uL，加入600uL去离子水稀释10倍。 2. 将稀释的黄酮提取液用60%甲醇定容至5mL。 3. 加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min。 4. 再加入10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀后放置6min。 5. 加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用60%甲醇定容至10mL，静置10min。 6. 以零管为空白，摇匀后在510nm波长处测定吸光度。 7. 根据芦丁标准曲线按公式计算黄酮总含量。 3实验结果
3.1紫外分光测定吸光度 以芦丁为标准品绘制标准曲线.芦丁溶液质量浓度X (ug/mL)与吸光度值A的关系曲线的回归方程式: A＝0.0103 X + 0.0154。取2 mL提取液于25 mL比色管中,在510 nm处测定吸光度.参比为空白试剂,并代入回归方程计算其质量浓度. 测得的A＝0.260，求得X＝23.7476 ug／mL 最终每克竹叶中黄酮含量：23.7476×10×（100÷0.4）÷200＝0.2968 ug 3.2 竹叶提取物的特征性成分分析 高效液相色谱分析：
3.2.1 色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.0 mm×100 mm, 1.7 μm），流动相 A为0.5%的甲酸水溶液;流动相 B为色谱甲醇，流速为0.2 mL·min-1，分析时间：15 min，柱温：30 ºC，进样体积: 2.0 μL。
3.2.2洗脱条件：0～15min由 5% B变为100%B, 10～15 min由100%B变为5%B。
质谱条件 LC-MS 系统使用 ESI 离子源，在正离子模式与负离子模式下分别采集数据。 数据采集范围 m/z100~1 000。离子源参数 ESI：毛细管电压：3000 V，样品锥电压 30 V，脱溶剂室温度 250 ℃，离子源温度 120 ℃，雾化气(N2)体积流量 50 L·h−1，脱溶剂气(N2)体积流量 400 L·h−1。 Lock Mass参照溶液为： 亮氨酸脑啡呔， [M+H]+ ：556.277 1，[M−H]− ：554.261 5。 3.2.3样品测定 : 各待测液经微孔滤膜（0.45 μm）滤过后，进样测定，按标准曲线计算
各成分的量。 结果如图3-1,3-2 19-Dec-2014
Time1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00
AU0.05.0e-11.01.5
2.0
2.5
1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00%0
100S2-2014-12-191: TOF MS ES- 163 2.00Da4515.83
2.591.60
1.131.381.672.152.264.244.103.493.132.653.54
5.014.814.644.50
5.785.44
5.26
6.996.02
6.946.046.726.269.037.807.377.24
8.85
8.287.86
9.209.539.989.86
S2-2014-12-193: Diode Array 210 2.00DaRange: 4.4311.22
1.164.69
2.244.522.534.39
3.963.88
3.653.33
5.995.52
5.374.99
5.28
5.726.096.826.356.53
7.137.26
8.16
