碱法提取质粒

碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。

碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。

本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。

碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。

2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。

3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。

4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。

通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。

5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。

注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。

例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。

2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。

培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。

3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。

4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。

5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。

总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。

质粒提取之达人建议碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。

可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。

追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。

这是导致我的学生误入歧途的主要原因。

后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。

这就不得不让人感到悲哀了。

我想这恐怕和我们的文化有点关系。

中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。

经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。

所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。

如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。

生命科学是实验科学，它讲究动手。

如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。

一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。

每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。

下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。

2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。

3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。

通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。

4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。

5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。

6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。

7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。

8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。

9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。

10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。

11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。

12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。

质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。

质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。

一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。

二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。

在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。

通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。

在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。

通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。

三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。

2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。

3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。

4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。

5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。

6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。

7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。

8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。

9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。

10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。

四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。

通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。

2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。

碱裂解法提取质粒：原理和注意事项碱裂解法提取质粒：原理和注意事项质粒提取之达人建议碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。

可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。

追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。

这是导致我的学生误入歧途的主要原因。

后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师”也是这个状态。

这就不得不让人感到悲哀了。

我想这恐怕和我们的文化有点关系。

中国人崇尚读书，学而优则仕”的观念深入人心。

经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。

所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。

如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学”。

生命科学是实验科学，它讲究动手。

如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。

一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家”每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液1, 50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA，pH 8.0 ；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS ；溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

1.取1.5ml培养液倒入EP管中，4℃，12000rpm，离心30秒（小离心机）
2.弃上清，瞬时离心，将EP管倒置于吸水纸上数分钟，是液体流净
3.菌体沉淀重悬于100ul溶液I中（剧烈震荡），室温下放置5-10min（溶液I 4℃保存）
4.加入新配置的溶液II（裂解细胞，DNA变性，NaOH,SDS表面活性剂各100ul）200ul，盖紧关口，快速温和颠倒EP管数次，混合内容物
5.加入150ul预冷的溶液III（中和溶液II，防止裂解过度，4℃保存），盖紧管口，并倒置EP管，温和震荡10秒，是沉淀混匀。

冰浴5-10min，4℃，12000rpm，离心5-10min
6.上清液移入干净的EP管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1）约400ul，震荡混匀后，4℃下，12000rpm，离心5min
7.上清液移至干净EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀，-20℃静置30min，有利于酒精沉淀，然后4℃，12000rpm，离心10min
8.弃去上清，加入500ul的70%乙醇，洗涤沉淀，4℃下，12000rpm，离心5-10min
9.吸去上清液，使液体流净，真空干燥5min，4℃或室温干燥
10.加入RNA酶40ul，3℃，30min或者溶于40ulddH2O，储存于-20℃冰箱中。

姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一一、实验目的1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。

2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。

溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。

由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。

质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

三、实验仪器和材料试剂仪器：恒温振荡培养箱，高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管，三角瓶等菌体：含质粒puc19菌株 E.coli DH5α受体菌试剂：LB培养基，氨苄青霉素AP，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液1X，上样缓冲液。

四、实验步骤1.含质粒puc19菌株的培养及收获E.coli DHSα（puc19）→LB培养基+AP→37°c 12~16h→LB培养基+AP→37°c 4~6h→500μl管称重(14.239g) →取菌液300μl→配平离心6000转5min→弃清→加5ml Sol I混匀→6000转5min→弃清→称重(菌体与离心管总重量为14.425g)→菌体称重（0.187g）2. 细胞裂解提取质粒DNA加Sol I 2ml 菌体漩涡混匀，冰浴5min加Sol II 2ml 轻柔颠倒混匀，冰浴5min加Sol III 1.5ml轻柔颠倒混匀，冰浴5min平衡，12000转15min→转上清至新50ml管（V1=8.8ml）加（2V1=17.6ml）冰乙醇，颠倒混匀→-20°c 30min12000转15min→弃上清→5ml 70%乙醇洗涤12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min1mlTE溶解→粗提物3.质粒DNA的纯化1.0ml粗提物+100μg RNaseA→37°c 1~2h→等分500μl x2份→加等体积分液，混匀→12000转姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一5min→转上清至新管→加等体积酚，氯仿异戊醇→12000转5min→转上清至新管→加等体积氯仿异戊醇混匀→12000转5min→转上清于新管→加1/10体积=22.0μl 3M NaAc，混匀，此时两管中液体体积均为242μl→加2倍体=484μl的积冰乙醇混匀→-20°c 30min→12000转15min→弃上清→70%乙醇500μl洗涤→12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min→25μl TE管溶解→共50μl质粒DNA/组4. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA五、实验结果1.本次试验电泳条带还算清晰，点样处有亮带，说明有杂蛋白2.染色体DNA条带比较暗，说明含量很低，提取样品纯度还算理想3.与marker比较我们提出的质粒分子量在范围之内4.与未添加RNase相比较，我们未出现模糊条带，证明RNase效果明显且操作方法正确5.出现RNA条带可能的原因是RNase反应时间不够或者反应混合不充分造成六、注意事项1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。

碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及提取中可能出现的问题一、质粒提取三种溶液的作用：1.溶液I溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。

如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。

有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

1. 溶液II溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS轮到溶液II了。

这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。

要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。

用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。

一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。

2. 熟悉实验过程中所使用的仪器和试剂。

3. 学习质粒DNA的纯化和检测方法。

二、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法，其原理基于质粒DNA与染色体DNA在变性和复性过程中的差异。

在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

而质粒DNA由于具有共价闭合环状结构，其氢键断裂后，两条互补链仍保持一定程度的结合。

当pH值调节至中性时，质粒DNA能够迅速复性，而染色体DNA则不能复性，形成缠连的网状结构。

通过离心，可以将复性的质粒DNA与未复性的染色体DNA及其他杂质分离开。

三、实验材料1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量离心管、移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。

2. 试剂：LB液体培养基、含质粒的大肠杆菌、溶液I（50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mg/mL溶菌酶）、溶液II（200 mmol/L NaOH、1% SDS）、溶液III（3 mol/L NaAc，pH 4.8）、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA）、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、溴化乙锭（EB）等。

四、实验步骤1. 将含质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。

2. 取适量菌液，8000 rpm离心2分钟，收集菌体。

3. 将菌体沉淀用溶液I重悬，加入溶菌酶溶液，室温放置10分钟。

4. 加入溶液II，混匀，65℃水浴10分钟。

5. 加入溶液III，混匀，室温放置5分钟。

6. 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。

7. 向上清液中加入等体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。

8. 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。

9. 用70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。

10. 弃去洗涤液，将沉淀溶解于TE缓冲液中。