Trizol法提取全血总RNA
实验前准备:
Trizol,氯仿,异丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配制),RNase-Free水,柠檬酸钠抗凝管。1ml注射器,1.5、3ml EP管(DEPC处理过),大、中、小号枪头(DEPC处理)
150~250ul全血
加入10倍体积TRIzol(主要是异硫氰酸胍)(1.5ml~2.5ml),充分吹打混匀,室温静置5min (使核酸蛋白复合物完全分离)。
每1毫升的TRIzol试剂加入200ul的氯仿(300ul~500ul),静置3min,离心12000g,4℃,15min。
将上层水相转移到1.5ml EP管中,加500ul的异丙醇,上下颠倒混匀10s,室温静置10min,离心12000g,4℃,10min,弃上清。
加入1ml的75%乙醇,上下颠倒混匀10s,离心7500g,4℃,10min,弃上清。
室温下干燥5-10min(充分干燥不好溶解),加入50ul的RNase-free-water充分溶解RNA。
分光光度计测OD值。
(取2μl进行电泳,其余-80℃保存?)
#加入TRIzol后可选步骤:如样品中
含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外
物质(肌肉,植物结节部分等)可于
2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多
糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。
处理脂肪组织时,上层有大量油脂应
去除。取澄清的匀浆液进行下一步操
作。
▲分光光度计检测质量
取出2 ul定量,
测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)。
A260/A280=1.8~2.1,说明RNA质量可靠;
A260/A280<1.8,说明有蛋白污染;
A260/A280>2.1,说明RNA存在降解。
▲电泳检测
RNA电泳检测RNA完整性:配制1%的凝胶,上样,120V电泳20min,紫外灯下观察结果,若能看到28S和18S两条带,且亮度约为2:1,说明RNA完整性较好。