农药福美双对斑马鱼Col2a1基因表达的影响
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现代化畜牧生产环境与环境管理（七）
- 126 -农药福美双对斑马鱼Col2a1基因表达的影响4
董武 杨景峰 王思珍
(内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽市028042)
摘要 目的 福美双是一种广泛应用，也是被联合国环境规划署、联合国粮食及农业组织限制的一种农药（鹿特丹公
约）。本实验研究了应用非常广泛的福美双所引起斑马鱼的毒性及其作用机理。方法 使用福美双给受精后3小时（3
hpf）的胚胎3.5cm的培养皿内染毒（5-20 nM) 直至24 hpf.，观察斑马鱼的畸形率、死亡率、外观形态学变化、组织
学变化，以及进行原位杂交进行RNA水平变化的观察。结果 在24 hpf时，没有观察到各染毒组死亡率的明显提高，
通过组织学与软骨染色观察到脊索的变化，同时观察了斑马鱼Col2a1基因的表达，在染毒组观察到斑马鱼Col2a1基因
表达的欠缺。结论 本试验表明福美双引起特有的斑马鱼脊索弯曲，这种弯曲与Col2a1 基因相关联， 也说明斑马鱼
作为农药的生物学评价具有一定的可行性。
关键词 农药，杀虫剂，福美双，Col2a1，斑马鱼
福美双（Tetramethylthiuram Disulfide，英文名为Bis(dimethylthiocarbamoyl) Disulfide，Thiram，
Thiuram），中文别名 秋兰姆，赛欧散，阿锐生，是一种低毒杀菌剂，但有较高的蓄积性。福美双广
泛用于苹果黑斑病、梨黑腥病的防治 [1]
； 烟草和甜菜根根腐病、番茄、甘蓝黑肿病、瓜类猝倒病、
黄枯病的防治 [2]
；水稻稻瘟病、胡麻叶斑病、立枯病的防治 [3]
；麦类黑穗病、玉米、高粱黑穗病的
防治等等。
联合国环境规划署、联合国粮食及农业组织在2004年9月拟定《鹿特丹公约》,一项关于在国
际贸易中对某些危险化学品和农药标准的规定 [4]
。采用“事先知情同意程序”的具有法律约束力的国
际文书。谈判委员会决定把极为危险的农药制剂福美双含量为或超过15%的可粉化的粉剂制剂列入
暂行“事先知情同意程序”，并核准与之相关的决定指导文件草案。一些国家已经停止使用或严格控
制福美双的浓度，如丹麦禁止使用，日本规定在水中的福美双浓度不得超过0.006 mg/L [5]
。由此可
见，国际组织对二硫代甲氨基甲酸盐类农药的关注。有关它的毒性机制还不是很明朗，Tammy E等
报道福美双致使大鼠肾上腺素调节失控，排卵延迟 [6]
。小鼠下颌骨、肋骨畸形 [7,8]
，豚鼠的波状尾、
短下颌 [9]
，福美双可以引起小鼠、大鼠的神经毒性 [10]
，但有关二硫代甲氨基甲酸盐类农药对胚胎发
育的影响的研究是很少的。农药由农田、经由河流，再到海洋，对鱼类和其他水生生物构成一定的
威胁。尤其是鱼类胚胎的发育，如今模式动物斑马鱼的胚胎发育毒性试验逐步受到重视。因为斑马
鱼具有以下优点：1）、基因组计划已经基本完成，已知基因较多；2）、形态关联、毒性表达的相关
基因与许多脊椎动物相同；3）、全年多产卵、体积小，作为胚胎发育模型有丰富的研究背景；4）、
使用斑马鱼胚对母体无任何影响，且早期身体透明，可对发育过程直接观察；5）、与其他脊椎动物
相比生长快，短时间内可调查污染状况，或特定污染物的检查等很多优点 [11]
。另外，使用斑马鱼的
生物学评价法，它将使评价检测变得更加简便、快速、费用低廉，可进行大批量样品的筛选和检测。
基于斑马鱼的诸多优点，本研究进行了福美双农药对斑马鱼胚胎发育形态的影响，引起形态学变化
的成因，以及对相关控制基因进行了探讨。从而为有机农药的生物学评价提供一定的理论基础。
1材料和方法
1.1药物 福美双（Tetramethylthiuram disulfide, 日本和光纯药），其他的药物分别来自SIGAM或日本
和光纯药。
1.2 采卵及染毒 受精卵根据文献[12]
的方法，将斑马鱼(AB 系) 雌雄分别培养，并以L︰D=14︰10
光周期促熟，实验前一天混养。自然交配后，采集受精卵并放入盛有斑马鱼林格尔液(ZR液： 38.7
mmol·L-1 NaCl，1.0 mmol·L-1KCl，1.7 mmol·L-1 HEPES，2.4 mmol·L-1CaCl2， pH 7.2)的培养皿中，
置于28.5℃孵化箱(LTI-600ED)中孵化。受精后3小时开始染毒（24hpf，24 hours post-fertilization），
染毒时使用3cm培养皿，福美双溶于溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，按2、5、7、10、12、15、17以
及20 nM的浓度梯度，DMSO的最终浓度为0.1％加入药物，定容到3ml，每个培养皿并放入10个
受精卵，置于28.5℃孵化箱内续孵化。用含有0.1% DMSO的ZR液饲育的卵作为溶媒对照。
4基金项目：教育部回国留学启动基金，新世纪人才支持计划。 中国畜牧兽医学会家畜环境卫生学分会-
- 127 - 1.3 ．HE染色及软骨染色
HE染色安常规方法进行。软骨染色，取固定后的胚胎再Alcian Blue 8GR 中染色6小时，然后用梯
度酒精（90-20%）脱水，蛋白酶K 10 ug/L 处理30分钟，5％KOH 中浸泡1小时，之后水洗，添加
20％甘油固定，摄影。.
1.4 原位杂交 基本内容是按文献[13]
的方法进行。用蛋白酶K（10 µg·ml-1）室温消化15 min，然后
加入杂交液 (50% 甲酰胺，5×SSC，2mg·ml-1 Torula RNA， 200µg·ml-1肝素) 放于65℃的恒温箱中
1h（预杂交），再用含有Col2a1探针的杂交缓冲液更换，放于恒温箱中过夜。用2 ×SSC、0.2×SSC
在65℃恒温箱中各清洗30min，再用顺丁烯二酸 buffer (100mmol·L-1顺丁烯二酸，150
mmol·L-1NaCI，0.1%吐温20，PH 7.5)清洗15 min。用blocking buffer（2% blocking reagent，100mmol·L-1
顺丁烯二酸，150 mmol·L-1NaCI，0.1%吐温20，0.1% Trito x-100，pH7.5）在室温清洗1h，放入含
有4000倍稀释的抗-DIG抗体(Roche)并置于4℃冰箱中反应过夜。在清洗夜NTMT(100 mmol·L-1
Tris-HCI，pH 9.5， 100 mmol·L-1 NaCI， 50 mmol·L-1MgCI2， 0.1%吐温20) 中静置15min，使用
BM purple AP substrate precipitating (Roche)发色。
1.4 统计方法 试验所得数据为平均值±标准误差 (x-
±SEM),平均值间的有意差鉴定采用Student的t-
鉴定，有意水准为5% (P<0.05)
2．结果
2.1 福美双对斑马鱼外观形态的影响 为调查福美双的形态学异常，使用2-20 nM的福美双染毒。各
染毒组的死亡率与对照组没有显著差异，但在一些染毒组内观察到体节，脊索的波状弯曲等特有症
状，尤其是卵黄突起的减少，与福美双浓度呈正相关。
Fig. 1. 各种形态异常发生率以及死亡率的浓度依存性
从3 hpf 用福美双（2～20 nM）染毒 、在24 hpf观察畸形发生率和死亡率（■）。各种形态异常：脊索波状弯曲（●）、
卵黄突起的减少（▲）、体节变形（◆）。N=10.
2.2组织学变化。在30 hpf对胚胎进行固定，分别进行组织学切片与HE染色。福美双染毒组（20 nM)
的横断面的神经管，脊索与体节的组织结构扭曲，变形。
2.3 软骨染色 ３hpf 开始用20nM福美双连续染毒至24hpf 移到到正常的斑马鱼培养液中直至10天
进行软骨染色。结果观察到虽然短时间的染毒，同样引起不可逆脊索的弯曲。
2.4. 原位杂交 对照组与染毒组（20nM 福美双）在24 hpf 进行固定，然后进行 in situ hybridization.
结果发现对照组缺损率为6 / 29（20.7％），染毒组缺损率为19 / 28（67.9％）。 现代化畜牧生产环境与环境管理（七）
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Fig. 2. 脊索的组织学变化
A, B30 hpf分别表示对照组与福美双（20 nM)的横断面。Nt, 神经管， a 体节， n，脊索， 箭头表示变形的神经细
胞。
Fig. 3. 软骨染色
A为对照组，B为 ３hpf 开始用20nM福美双连续染毒至24hpf 移到到正常的斑马鱼培养液中直至10天进行软骨染
色。
3 讨论
有机食品概念的重视，我国对福美双一类农药的重视程度也不断地加强。本试验对福美双的引
起毒性的浓度作了一系列的探讨。本次试验使用的福美双浓度是相当低的浓度而本次试验中的最高
浓度20 nM （相当于4.8 µg/l），比我国的水质标准低。并且比一些国家的水质标准还要低。如日本
的水道法规定饮用水中的福美双不得超过6 µg/l，看来制定标准时，不能单单以动物的死亡率、LD50
为标准，同时也要考虑农药对动物有机体的组织病理学以及基因水平的影响。有关畸形的报道，福
美双可以引起精囊的畸形、抑制雏鸡的生长和肢体的畸形，还有鲑鱼的脊索弯曲等，但毒性机制，
还不很明了。本试验使用了斑马鱼作为实验动物模型，阐述了福美双特异性的引起斑马鱼的脊索波
状弯曲的组织学变化，通过软骨染色表明，福美双在短时间的染毒（24 h），同样引起不可逆脊索的中国畜牧兽医学会家畜环境卫生学分会-
- 129 - 弯曲。这种变化与胚胎糖原代谢相关的Col2a1基因的表达有密切的关系。通过本试验说明斑马鱼作
为农药的生物学评价具有一定的可行性。
Fig. 4. 福美双对斑马鱼Col2a1基因表达的影响
对照组与染毒组（20nM 福美双）在24 hpf 进行固定，然后进行 in situ hybridization. C、D是A,B的放大像。箭头
表示表达缺损的部位。
参考文献
[1] 张勇.当前果园农药应用现状[J].河北果树, 2003(06): 34-35.
[2] 李盛贤, 张颖舒, 杨光.速克灵、福美双对蕃茄灰霉病病原菌联合毒力的研究[J].黑龙江大学自然科学学报,
2001(02): 95-97.
[3] 王金霞, 邵桂珍, 金明棠et al.水稻“牡丰”壮秧剂防治水稻苗期立枯病试验总结[J].现代农业, 2003(07): 43.
[4] UNEP/FAO/PIC/INC.10/1/Add.1.联合国环境规划署、联合国粮食及农业组织，11 August 2003[J]..
[5] 孙晶.丹麦将禁止二百种农药[J].世界农药, 1997(04): 24.
[6] Stoker TE, Jeffay SC, Zucker RMet al.Abnormal fertilization is responsible for reduced fecundity following
thiram-induced ovulatory delay in the rat.[J].Biol Reprod, 2003, 68(6): 2142-49.
[7] Roll R.[Teratologic studies with Thiram (TMTD) on two strains of mice][J].Arch Toxikol, 1971, 27(3): 173-86.
