急性脑梗死大鼠CD4^+CD25^+调节性T细胞及caspase-3的表达及相互关系

・７２・　医药论坛杂志２０１５年１１月第３６卷第１１期Ｊ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｆｏｒｕｍ　Ｖｏ１．３６　Ｎｏ．１１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１５　总之，这种手术能很好地矫治这种复杂先天　心脏畸形，近期结果良好，但是由于病例数有限，　随访时间短，这种术式的中远期效果还有待于进　一步观察。另外此术式操作复杂，术中变化多，对　术者要求较高，限制了此术式的推广应用。　

参考文献　［１］刘迎龙．完全性大动脉转位的外科治疗［Ｊ］．中国循环杂志，　２００５．２０（６）：４７５４７６．　［２］　Ｒａｓｔｅｌｌｉ　ＧＣ，Ｗａｌｌａｃｅ　ＲＢ，Ｏｎｇｌｅｙ　ＰＡ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｏ—　ｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｅａｔ　ａｒｔｅｒｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｓｔｅｎｏｓｉｓ．Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ａｎｄ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ａ　ｃａｓｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｎｅｗ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９６９，３９（１）：８３－９５．　［３］　Ｒａｓｔｅｌｌｉ　ＧＣ．Ａ　ｎｅｗ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ“ａｎａｔｏｍｉｃ”ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｏｓｉ－　ｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｇｒｅａｔ　ａｒｔｅｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｍａｙｏ　Ｃｌｉｎ　Ｐｒｏｃ，１９６９，４４（１）：１－　１２．　［４］Ｌｅｃｏｍｐｔｅ　Ｙ．Ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａ　ｌＥｔａｇｅ　Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｉｒｅ—Ｔｈｅ　ＲＥＶ　ｐｒｏ—　

ｃｅｄｕｒｅ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｌ　Ｙｏｕｎｇ，１９９１，　１（１）：６３—７０．　［５］Ｄｅａｒａｎｉ　ＪＡ，ＤａｎＭｓｏｎ　ＧＫ，Ｐｕｇａ　ＦＪ，ｅｔ　ａ１．Ｌａｔｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒａｓｔｅｌｌｉ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｅａｔ　ａａｅｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ　Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｃａｒｄ　Ｓｕｒｇ　Ａｎｎｕ，２００１．４：３—１５．　［６］　Ｎｉｋａｉｄｏｈ　Ｈ．Ａｏｒｔｉｃ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｏｕｔｆｌｏｗ　ｔｒａｃｔ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ａ　ｎｅｗ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｒｅｐａｉｒ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｅａｔ　ａｒｔｅｒｉｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒ　ｓｅｐｔａｌ　ｄｅｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｐｕｌｍｏ—　ｎａｒｙ　ｓｔｅｎｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ，１９８４，８８（３）：３６５—　３７２．　［７］　胡盛寿，李守军，王欣，等．改良主、肺动脉根部置换术治疗伴　左室流出道梗阻的大动脉错位［Ｊ］．中国胸心血管外科临床　杂志，２００７，１４（１）：１－５．　［８］Ａｌｌｅｎ　ＢＳ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：Ａ　ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉｃ　ｓｔｒａｔｅ—　ｇＹ　ｉｓ　ｔｈｅ“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ”［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ　Ａｎｎｕ，　２００４，７：１４１—１５４．　收稿日期：２０１５－０６－０７修回日期：２０１５－０９－１０责任编辑：李慧　

・医学研究・　急性脑梗死大鼠ＣＤ４＋ＣＤ２５＋调节性Ｔ细胞及　ｃａｓｐａｓｅ一３的表达及相互关系　

李楠　一，顾志强　，王建平　，蒋超　１．郑州大学第二附属医院神经内科，郑州４５００１４；２．郑州大学第五附属医院神经病学博士研究生　３．郑州大学第二附属医院放射科；４．郑州大学第五附属医院神经内科　

摘要：目的探讨ＣＩＭ　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞对脑梗死的作用。方法雄性ｗｉｓｔａｒ大鼠４０只，随机分为大脑中　动脉闭塞（ｍｉｄｄｌｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）２４　ｈ、７２　ｈ、１周、２周组和假手术组，检测造模后血中ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞和皮层ｃａｓｅｐａｓｅ一３蛋白的表达。结果造模后２４ｈ、７２ｈ　ＭＣＡＯ组与假手术组比较无显著　差异性（Ｐ＞０．０５），在１周、２周后ＭＣＡＯ组与假手术组有显著差异性（Ｐ＜０．０５）；ＭＣＡＯ组２４ｈ皮层有Ｃａｓｐａｓｅ　一３阳性表达，积分光密度较假手术组有显著差异性（Ｐ＜０．０５）。结论不同时间点随ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细　胞的表达增多，皮层Ｃａｓｐａｓｅ一３表达量及核阳性率逐渐衰减，表明ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性对脑梗死有保护作用。　关键词：急性脑梗死；ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞；Ｃａｓｐａｓｅ一３；大鼠　中图分类号：Ｒ一３３２　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—３４２２（２０１５）１１－００７２—０２　

脑梗死是当今世界成人死亡和致残的主要原　因之一，研究发现在脑梗死后梗死组织周边存在　明显炎性免疫反应¨　。ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细　胞具有免疫调节作用，但目前仍不太清楚它是起　着“促炎反应”而有神经破坏作用，还是“抑炎反　应”具有神经保护作用。Ｃａｓｐａｓｅ一３在细胞凋亡　分子机制网络中起关键作用，Ｃａｓｐａｓｅ一３在脑梗死　后神经细胞凋亡中起重要调控作用　Ｊ。因此，本　研究拟动态观察脑梗死后外周血ＣＤ４　ＣＤ２５　调　通讯作者：王建平，Ｅ—ｍａｉｌ：５３４２１６２７６＠ｑｑ．ｃｏｒｎ　节性Ｔ细胞的变化，梗死灶组织Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白　的变化，继而进一步探讨ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细　胞在脑梗死后的免疫调节作用。　

１材料与方法　１．１　实验动物及分组４Ｏ只成年雄性ｗｉｓｔａｒ大鼠　（郑州大学实验动物中心提供，体重２００～２２０ｇ）按　照随机化原则分组，分别为大脑中动脉闭塞（ｍｉｄ—　ｄｌｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）２４　ｈ、７２　ｈ、１　周、２周组和假手术组，每组８只。　１．２　ＭＣＡＯ模型制作采用线栓法制作ＭＣＡＯ　医药论坛杂志２０１５年１１月第３６卷第１１期Ｊ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｆｏｒｕｍ　Ｖｏ１．３６　Ｎｏ．Ｉ１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１５　・７３・　模型　］：术前禁食１２ｈ，３．６％水合氯醛（ｈｎｌ／１００ｇ）　腹腔注射麻醉，颈正中线切口，分离右侧颈总、颈　外及颈内动脉，结扎颈总近心端和颈外远心端；在　距颈总动脉分叉部约４．０ｒａｍ处剪一小口，将栓线　插入轻推至颈内动脉，深度约１８ｍｍ，固定线栓并　缝合伤口，２ｈ后拔线；假手术组只分离动脉，无线　栓步骤；术后２４ｈ动物清醒后，应用Ｚｅａ　Ｌｏｎｇａ　等Ⅲ４　的方法进行神经功能评分。０分，无症状；１　分，不能完全伸展左前肢；２分，行走向左侧转圈；３　分，行走时向左侧倾倒；４分，存在意识障碍。１～３　分为模型制作成功。　１．３外周血中ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞的检测　大鼠麻醉后心脏取血，加ＣＤ４一ＦＩＴＣ　１Ｉｘｌ、ＣＤ２５　

一Ｐｅｒｃｐ和ＩｇＧｌｋ—Ｐｅｒｃｐ０．５Ｉｘｌ（美国ｅＢｏｉｓｃｉｅｎｃｅ公　司）到检测管和对照管，混匀，室温孵１５ｒａｉｎ，加　０．５ｍｌ破膜液（博士德生物技术有限公司），混匀，４　度冰箱暗孵４５ｒａｉｎ，再加破膜液２ｍｌ，１８００转／ｒａｉｎ　离心５ｒａｉｎ；加Ｆｏｘｐ３一ＰＥ和ＩｇＧ２ａｋ—ＰＥ　５　ｌ（美国　ｅＢｏｉｓｃｉｅｎｃｅ公司）及加破膜液１ｍｌ，离心洗涤，加　１％多聚甲醛０．５ｍｌ重悬，上流式细胞仪（美国贝　克曼库尔特公司）检测分析。　１．４脑梗死后皮层Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达术后　相应时间点大鼠全麻条件下取脑制备连续冠状切　片，片厚５ｕｒｎ。ＳＡＢＣ法（即用型ＳＡＢＣ免疫组化试　剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司）进行　Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达阳性的细胞测定。　１．５统计分析数据采用Ｅｘｃｅｌ及ＳＰＳＳ１６．０软　件处理，单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ），Ｓｐｅａｒｍａｎ相　关分析变量间关系，Ｐ＜０．０５为有显著差异性。　

２结果　２．１　外周血ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞的变化　在造模后２４ｈ、７２ｈ时ＭＣＡＯ组与假手术组无显著　差异性（Ｐ＞０．０５），在１周及２周时ＭＣＡＯ组表达　明显高于假手术组（Ｐ＜０．０５），见表ｌ。　表１两组不同时期ＣＩＭ　ＣＤ２５　调节性　Ｔ细胞的表达（面±５）　

１周　２周　ＭＣＡＯ组７．８１４±０．５４３　８．６９０±０．７８０　１０．３４５±１．２５４　１５．０４２±１　２１３　假手术组７．７６７±０．６７８　８　０７８±０．４６７　７．８７８±０．３４３　８．１４５±Ｏ．６７７　２．２大鼠皮层Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达　ＭＣＡＯ组　大鼠２４ｈ在大脑皮层有Ｃａｓｐａｓｅ一３阳性表达，７２ｈ　达高峰，１周及２周后数量持续减少，积分光密度　较假手术组有显著差异（Ｐ＜０．０５），见表２。　

表２大鼠皮层各时间点Ｃａｓｐａｓｅ一３　蛋白表达（　±ｓ）　

组别　２４ｈ　７２ｈ　１周　２周　ＭＣＡＯ组０．７９±０．０２　０．８７±０．０４　０．６０±０．０１　０．５０±０．０１　假手术组０．３０±０．０２　０．３１±０．Ｏ１　０．３１±０．Ｏｌ　０．３１±０．０１　

３讨论　脑梗死后炎症因子和趋化因子增高，加重脑　损伤。ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞主要在机体免疫　中维持外周免疫耐受，发挥负向调节作用，防止免　疫反应过度，Ｂｒｕｓｋｏ等　发现该Ｔ细胞不仅可以　抑制ＣＩＭ　和ＣＤ８　细胞介导的免疫反应，还可以　抑制自然杀伤细胞及树突状细胞，使脑梗死后的　免疫损伤反应程度减低，继而可能改善脑梗死的　结果。ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞可能在梗死后神　经功能的再生和修复中起重要作用。　目前研究认为中枢神经系统细胞凋亡途径较　重要的是线粒体途径，其具体过程中受多基因调　控，Ｃａｓｐａｓｅ一３是细胞凋亡分子机制网络中的关键　酶。Ｃａｓｐａｓｅ一３在脑梗死后细胞凋亡中起重要调　控作用。本实验发现不同时间点随着ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞的表达增多，皮层Ｃａｓｐａｓｅ一３　表达量及核阳性率逐渐衰减，表明ＣＤ４　ＣＤ２５　调　节性很有可能具有保护脑梗死后组织进一步损伤　的作用。ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞可调控中枢神　经系统炎症性疾病中的免疫应答反应，本研究提　示ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞参与了脑梗死后的　免疫调节，对梗死后的脑组织保护作用。　

参考文献　［１］　Ｏｆｆｈｅｒ　Ｈ，Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ　ＡＡ，Ｈｕｍ　ＰＤ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｏｋｅ　ｏｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ＣＮＳ　ｉｓｅｈｅｍｉａ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｐｒｏｆｏｕｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ【Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｅｉｅｎｃｅ，２００９，１５８（３）：１０９８—　１１１１．　［２］Ｐａｎｋａ　ＯＪ，Ｗａｎｇ　Ｗ，Ａｔｋｉｎｓ　ＭＢ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｒａｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＢＡＹ　４３