红曲米中七株红曲霉纯培养的分离鉴定

２００６年１１月　

第６期　广西轻工业　

ＧＵＡＮＧＸＩ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＬＩＧＨＴ　ＩＮＤＵＳＴＲＹ　（总第９７期）　

红曲米中七株红曲霉纯培养的分离鉴定　

毛瑞丰，楚文靖，王瑞恒，仁绍坤　

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁５３０００４）　

【摘　要】从广西武宣地区的红曲米中分纯得到７株红曲霉纯培养。初步鉴定分属３类：Ｍ一１、Ｍ一２、Ｍ一６属于紫色红曲霉　

类，Ｍ一４、Ｍ一５属于红色红曲霉类，Ｍ一３、Ｍ一７属于丛毛状红曲霉类。发现Ｍ－１茵株具有较为突出的红曲色素产生能力，通过形　

态观察和耐酒精、耐ＮａＣｌ实验，对Ｍ一１菌株进行了种的鉴定。　

【关键词】红曲米；红曲霉；分纯；鉴定　

【中图分类号】ＴＳ２０１．３　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００３—２６７３（２００６）０６—０００９—０２　

自１８８４年Ｖａｎ　Ｔｉｅｇｈｅｎ首次分离出红曲霉，至今已有百　

年的历史。近几年红曲霉的许多功效相继被证实后，红曲菌的　

相关专利陆续出现。自１９７５年至１９９７年为止各国关于红曲　

霉的专利将近２００篇【ｎ。目前红曲色索应用是红曲研究的主要　

方向，近２０年有近４０％的专利都在此领域。１９７９年红曲霉被　

发现可产生胆固醇合成抑制剂，红曲霉降血糖、血压及胆固醇　

功效即成为众人关注的焦点踊。　

另外作为食品添加剂也是红曲应用的主要方向，有关添加　

红曲成为功能性食品的专利有３１篇，且多在日本申请。还有用　

于生产各种酶的专利１５篇，以及在化妆品、处理废水、饲料上　

的应用【３］。对红曲霉的研究已从红曲色素扩展到有关降血压、　

血糖及胆固醇，红曲霉抗菌作用等多个方面。　

本论文报道了对广西所产红曲米中红曲霉的分离纯化工　

作。对广西武宣一带的红曲米中的红曲霉进行分纯，得到了７　

个纯培养，进行了属的鉴定。发现其中一株有较为突出的抗菌　

能力（另文发表）；还有一株有较为突出的产红曲色素能力。研　

究成果扩大了红曲霉的菌种库，为发掘红曲霉生物资源做了有　

益工作。　

１实验材料　

１．１红曲米：取自广西武宣地区，是居民制作红糟酸所用的发　

酵剂。　

１．２培养基：富集活化液：１２￣Ｂｘ米曲汁９００ｍＬ，乳酸７ｍＬ，无　

水乙醇１ＯＯｍＬ，于１２１℃灭菌２０ｒａｉｎ，使用时以无菌操作加入　

３０ｐｐｍ链霉素。分纯培养基：１２。Ｂｘ米曲汁９００ｍＬ，６％ＮａＣ１。　

２％琼脂，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。　

２研究方法　

２．１红曲霉的分纯与鉴定：取红曲米２５粒放入１ＯＯｍＬ富集活　

化液中，３０℃培养５天。采用米曲琼脂汁培养基，对数稀释倾　

注法分纯。以无菌操作将生长迅速、健壮的菌落，挑取放到富集　

活化液中继续富集活化，待培养５天后重复上述分纯操作，经　

过多次操作就可以分离得到红曲霉纯培养。　

通过菌落形态、菌丝体形态观察，耐酒精、耐ＮａＣＩ实验，进　

行红曲霉纯培养的鉴定。　２．２红曲霉产红曲色素的研究：用米曲汁培养基，遮光，３２ｃＩ＝，　

１６０ｒ／ｍｉｎ培养六天。用分光光度法测定总色价。　

３实验结果　

３．１红曲霉的富集活化　

活化培养的第二天，红曲米开始有附着的白色菌丝；第三　

天红曲米上浮，米身附着大量菌丝；第四天红曲米全部上浮，菌　

丝开始粘连；五天以后出现白色菌膜；七八天后白色菌膜转变　

为红色。根据菌体质量测定，红曲霉生长对数期大约处于第五、　

第六天，最适合用作接种材料。　

３．２红曲霉的分离鉴定　

３．２．１茵落形态特征红曲霉培养初期都为白色小菌落，经过　

培养后，菌落开始老熟，表面的颜色变化比较丰富，有的菌落颜　

色开始改变，逐渐变成橙色、浅蓝色、灰色、铅灰色和灰白色等；　

菌落的主要形状为皮膜状和绒毯状，大多菌落有放射状的沟　

纹，边沿一般比较整齐。得到７个纯培养，菌落特征见表１。　

表Ｉ　７株红曲霉纯培养的茵落形态　

注：①茵落从里至外为三个色环，颜色依次为灰色、绿色和白色；　

⑦茵落从里至外为两个色环，颜色依次为灰色和白色；（　茵落从里至　

外为两个色环，颜色依次为绿色和白色。　

３，２．２个体形态特征３０℃培养３天的红曲霉纯培养，用手术　

刀切取大小约１×１ｍｍ的菌苔，制成水漫片。镜检观察个体形　

态．７个菌株均观察到细胞横隔，有足细胞，梨形的分生孢子，　

有的还观察到闭囊壳结构．如图１。　

【作者简介】毛瑞丰（１９６３－）．男。广西桂林人，广西大学轻工与食品学院博士研究生。　

【基金项目】广西大学科研基金（）（∞２ｏｏ　９）　

９　维普资讯 http://www.cqvip.com 注：生长申的孢子囊　

注：气生菌丝和足细胞　注：成熟的孢子囊　注：分生孢子链　

壤　誊：　

注：分权菌丝　注：闭囊壳　

图１　红曲霉的个体形态图（６４（１×）　

３．２．３曲霉纯培养的分类　

根据以上形态观察结果，将７株纯培养鉴定为红曲霉属Ｅ日。　

根据１９９２年ＡＴＣＣ真菌目录，红曲霉菌主要可分为三大　

类。按照文献的检索方法对所得的７个菌株进行测定后，分类　

结果见表２。　

表２　７株红曲霉纯培养的分类结果　

Ｍ一１、Ｍ－２、Ｍ－６属于紫色红曲霉类（Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ），Ｍ一４、　

Ｍ－５属于红色红曲霉类　．ｔｕｂｅｒ），Ｍ一３、Ｍ一７属于丛毛状红曲　

霉类　．ｐｉｌｏｓｕｓ）。　

３．３　Ｍ一１的红曲色素产生能力　

分纯过程中发现Ｍ一１菌株的菌落及其培养液显示出突出　

的红色，我们对其进行了种的鉴定和红曲色素产生能力的测　

定。　

３．３．１根据ＰＤＡ平板上３０￣Ｃ培养７天的结果和耐乙醇、ＮａＣ１　

特征可以对Ｍ一１菌株进一步分类，结果如表３所示。　

表３　Ｍ－１茵株的分类特征　

１０　根据检索表嘲。将Ｍ一１菌株鉴定为Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ　Ｗｅｎ紫色红曲　

菌。　

３．２．２　Ｍ一１、Ｍ一２、Ｍ－３、Ｍ－４产虹曲色素的能力　

米曲汁培养基，３２￣Ｃ，１６０ｒ／ｍｉｎ遮光培养六天。用分光光　

度法测定总色价。结果见表４。　

表４　Ｍ－１。Ｍ－２，Ｍ一３，Ｍ一４茵株产色素能力对比　

可见Ｍ一１菌株产红曲色素能力十分突出，发酵液总色价　

为１４４．２　／ｍＬ。　

４结论　

４．１从广西武宣红曲米中获得了７个红曲霉纯培养Ｍ一２、　

Ｍ一６、Ｍ一１属于紫色红曲霉类　．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ），Ｍ一５、Ｍ一４属于红　

色红曲霉类　．ｒｕｂｅｒ），Ｍ一３、Ｍ一７属于丛毛状红曲霉类　．　ｐｉｌｏｓｕｓ）。　

４．２成功筛选到一株发酵液总色价为１４４．２　Ｉ的红曲霉菌　

株Ｍ一１　经形态观察和耐酒精、耐ＮａＣ１能力实验鉴定为紫色　

红曲霉（Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ　Ｗｅｎ）。说明广西武宣地区的红曲米中的　

红曲霉在产生红曲色素方面具有较高的研究潜力。　

（下转第２１页）　，　．　

Ｑ　维普资讯 http://www.cqvip.com ２．１分析条件选择　

经实验选择Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＮＨ：柱作为分离柱，以乙腈，水为流　

动相。虽提高流动相中水的比例可以加快分离过程。但容易造　

成其中果糖和葡萄糖色谱峰的部分重叠，在兼顾分离速度和分　

离效果的基础上，我们确定了乙腈，水为８０／２０（体积比）为流动　

相，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ。采用ＥＬＳＤ对被分离成分进行检测。设　

定漂移管温度１００℃，氮气流速为２．５ｍＬ／ｍｉｎ。图１为此条件下　

标准品（Ａ）和样品（Ｂ）的色谱图。　

果糖　７．０８５ｒａｉｎ　

葡萄糖７．９７１ｍｉｎ　

蔗糖　１１．１１６ｍｉｎ　

麦芽糖１２．９４８　

图１标准品（Ａ）和样品（Ｂ）的色谱图　

２．２线性范围和检出限　

取一系列标准工作溶液１５　Ｌ进样分析。以标准品峰面积　

对标准工作溶液浓度进行线性回归，得到４种标准品的回归方　

程和相关系数，见表２。以信噪比等于３为标准，测得果糖、葡　

萄糖、蔗糖和麦芽糖的检出限，见表２。　

表２　４种组分的回归方程厦检出限　

２．３精密度实验　

精密配制果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的浓度分别为　

２０ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、２ｍ￣ｍＬ和２　ｍ＃ｍＬ的混合对照品溶液，　

平行测定５次．计算各组分蜂面积的相对标准偏差（ＲＳＤ％）分　

别为２．８％、３．２％、３．５％、２．１％。　

２．４回收率实验　

在已知糖含量的蜂蜜样品中分别加入已知量的果糖、葡萄　

糖、蔗糖和麦芽糖的标准溶液后，色谱条件不变，再次对样品进　

行平行测定５次，按照外标法定量并计算其回收率，结果见表３。　

表３样品的加标回收率　２．５样品的分析　

对市售的４种蜂蜜样品进行测定，结果表明，４种蜂蜜样　

品中糖分主要有葡萄糖和果糖，以及很少量的麦芽糖，蔗糖未　

检出。结果见表４。　

表４各蜂蜜样品的测定结果（ｎ＝４）　

样品　果糖（ｇ／［００ｇ）　葡萄糖（ｇ，ｌ００ｇ）　蔗糖（ｇ，ｌ∞ｇ）　

百花蜜　３Ｉ．３８　２８．７０　一　

龙眼蜜　３９．５２　２３．９８　一　枣花蜜　３４．７２　３２．２６　一　荔枝蜜　３４．９６　２６．９２　一　麦芽糖（　１ｏｏｇ＞　

２．３４　

ｌ＿９６　１．５Ｂ　

３结论　

本文研究了液相色谱一蒸发光散射检测法在测定蜂蜜中　

果糖、葡萄糖，蔗糖、麦芽糖中的应用，研究表明，该法简便快　

速，灵敏度高，重现性较好，为测定蜂蜜中的４种糖分提供了准　

确、可靠的分析方法。　

参考文献　

…１　ＧＢ１８７９６－２００５（（蜂蜜》强制性国家标准【ｓ】．　

ｆ２］２　ＳＮ／Ｔ０８５２－－２０００出口蜂蜜检验方法【ｓ】．　

『３１３国家出入境检验检瘦局．ＡＯＡＣ（美国公职分析化学协会）编译委　

员会．公定分析方法（第十五版）［Ｍ】．北宗：中国科学出版社，１９９１．　

【４］４　ＧＢ／Ｔ１８９３２．２２－－２００３蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的　

测定方法一液相色谱示差折光检测法【ｓ】．　

【５】崔鹤，李戈登．离子色谱脉冲安培法测定蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗　

糖卟化学分析计量，２００１，１：２５—２６．　

【６］吴艳华。刘伟等．ＨＰＬＣ内标法与化学法测定蜂蜜中糖含量的比较　

【１１．应用科技，２００１，８：５５－－５９．　【７】Ｃ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ＿用ＨＰＬＣ和蒸发光散射检测对糖类分析的方法学Ｕ】．　

国外分析仪器．２００２．２：２６－－２９．　

（上接第１　Ｏ页）　

４．３关于Ｍ一１号菌株所产色素的成分、性质还有待进一步研　

究和探讨　

以Ｍ一１作为出发菌株，通过诱变育种和基因工程，开发红　

曲色素生产菌株具有研究价值。　

参考文献　

…１陈彦霖．李昭蓉。陈建州等．红曲茵种的研究开发与应用Ｕ１．食品工业　

月刊（台），１９９８，３０．　

【２］路秀玲，赵树欣，宫慧梅．红曲霉的应用研究现状与展望Ｕ】．食品科　

技，２００１，（】）：４３—４６．　

Ｉ３】贾波Ｉ周立平．红曲霉研究之现状厦发展前景Ｄ】．中国食品添加荆，　

２００２。（６）：３２—３５．　【４】瑰景超．真茵鉴定手册【Ｍ】．上海：上海科学技术出版社．１９７９：　

１２９—１３６，　

【５】戴芳澜．真菌的形态和分类【ＭＪ．北京：科学出版社．１９８７．３．

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