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RNA干扰靶向抑制PI3Kp85α蛋白对大肠癌细胞侵袭、转移的影响研究

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２０１２　ＮＯ　２３　Ｃ。。。。Ｈ　。。。Ｉ。。Ｎ。。。　Ａ。。‘。。。Ｆ。。—Ｏ—Ｒ——ＥＩＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　临床医学　

Ｒ２ＮＡ干扰靶向抑制ＰＩ３Ｋ　ｐ８５　ｏ【蛋白对大肠癌细　

胞侵袭、转移的影响研究　

宋洋　徐正磊　张茹　深圳市人民医院暨南大学附属第二临床医学院消化内科，广东深圳５１８０００　

［摘要】目的分析ＲＮＡ干扰靶向抑制ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｄ表达对大鼠大肠癌细胞的侵袭及转移的影响。方法设计１条阴性载体及４　

条ｓｈＲＮＡ干扰载体转染大肠癌细胞，检测ｓｈＲＮＡ干扰载体对减少ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ蛋白表达的作用。结果ｓｈＲＮＭ　３２４转染组　ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｃ￣蛋白表达量降低幅度最大；转染ｓｈＲＮＡ／３２４载体的干扰组ＬｏＶｏ细胞迁移能力显著减弱　０．０５１　结论ＲＮＡ干　

扰靶向可有效抑制ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ表达并降低肿瘤细胞运动迁移能力。　

【关键词】ＲＮＡ干扰；ＰＩ３Ｋ　ｐ８５仪蛋白；大肠癌　［中图分类号】Ｒ７３５．３４　［文献标识码１　Ａ　【文章编号】１６７４—０７４２（２０１２）０８（ｂ）一００２８—０２　

随着对与肿瘤发生的相关基因研究发现，磷脂酰肌醇３一激　酶（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎ０ｓｉｔｏ１　３－ｋｉｎａｓｅ，ＰＩ３Ｋ）和ＡＫＴ通路等与肿瘤密　

切相关信号通路，逐渐引起重视Ｉ　。ＰＩ３Ｋ信号参与细胞的增殖、分　化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞过程，而研究发现．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ　信号通路在大肠癌中处于激活状态　。该组研究拟检测正常大肠　粘膜、大肠腺瘤、大肠癌组织中ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｅ￣表达的变化趋势　然　

后设计针对Ｐｌ３Ｋ　ｐ８５ｏ￣的ＲＮＡ干扰片段，转染大肠癌细胞后。　测定ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ的ｍＲＮＡ、蛋白表达量，分析干扰效果。报道如　

下。　

１材料与方法　１．１　ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ．ｓｈＲＮＡ的设计与制备　自ＧｅｎＢａｎｋ中选择人类ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｃ￣亚单位编码基因ＰＩＫ３Ｒ１　

ｍＲＮＡ序列（ＮＭ＿ｌ８１５０４１，按ｓｈＲＮＡ设计一般原则，设计４条　ｓｈＲＮＡ，依次命名为：ｓｈＲＮＡ／８９，ｓｈＲＮＡ／３２４，ｓｈＲＮＡ／１　０７３，　

ｓｈＲ—ＮＡ／１　１２３。阴性对照靶序列为：Ｃ１Ｔｒ　ＣＴＣ　ＣＧＡ　ＡＣＧ　ＴＧＴ　ＣＡＣ　ＧＴ，命名为：ｓｈＲＮＡ／Ｎ。ｓｈＲＮＡ的发卡袢状结构ＴＦＣ　ＡＧ　ＡＧＡ，转录终止子为．兀ＴＩＴＩ１。　１．２细胞培养和转染　

美国ＡＴＣＣ人结肠腺癌细胞株Ｌ０Ｖ０，使用含１０％的胎牛血清　

ｆ海诚远宏科技有限公司）的ＲＰＭＩ　１　６４０（Ｇｉｂｃｏ公司）常规培养　

传代。细胞融合度高于９０％时即开始转染，以Ｏｐｔｉ—ＭＥＭ培养液　将脂质体及质粒载体进行稀释。转染后２４　ｈ内，将１　０００　ｍＬＧ４１８　加入培养液中筛选。使用尖吸管吸取形成后的单细胞阳性克隆　群落，培养３０　ｄ后，用浓度为６００￣ｇ／ｍＬ的Ｇ４１８的培养液进行　培养。细胞分成５个对照组：①转染ｓｈＲＮＡ／Ｎ阴性对照组；②　

转染ｓｈＲＮＡ／８９的ＬｏＶｏ细胞组；③转染ｓｈＲＮＡ／１　０７３的　—　Ｖｏ组；（　转染ｓｈＲＮＡ／３２４的ＬｏＶｏ组；（　转染ｓｈＲＮＡ／１　１２３的　

ｌＪｏＶｏ组。　１．３蛋白质印迹法检测ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ蛋白的表达　

采用ＲＩＰＡ裂解液提取细胞总蛋白ｆ北京普利莱基因技　术有限公司），采用蛋白质印迹法检测ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ蛋白的表　达　

２８　中外医疗ＣＨＩＮＡ　ＦＯＲＥＩＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　１．４统计方法　所有统计均在ＷｉｎｄｏｗｓＳＰＳＳ　１７．０统计学软件中完成．计量　资料采用均数±标准差（ｘ＋ｓ）的方式记录，均数均以组间ｔ检验进　行比较，计数资料采用组间ｘ　检验。检验水平仪＝Ｏ．０５。　

２结果　

２．１转染后细胞ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｏｔ的表达　待稳定的转染克隆细胞形成后，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ测定　

ＲＮＡ干扰。研究结果发现．与阴性转染ＬｏＶｏ对照组对比，转染干　扰载体ＬｏＶｏ细胞ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｃ￣蛋白相对表达量分别降低３５％　

（ｓｈＲＮＡ／８９）、７６％（ｓｈＲＮＡ￣２４）、２３％（ｓｈＲＮＡ／１　０７３）、１　８％（ｓｈＲＮＡ／１　１２３），ｓｈＲＮＭ　３２４转染组比较，ｓｈＲＮＡ／３２４转染组ｓｈＲＮＭ８７转　染组均显著降低（１Ｐ＜０．０５）。其中，以ｓｈＲＮＭ　３２４转染组ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ　表达量减小幅度最高，因此，采用ｓｈＲＮＡ／３２４转染组为后续实　验感染组。　

２．２　ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ蛋白降低后细胞迁移能力　

２４　ｈ体外划痕研究发现，与阴性对照组比较，转染ｓｈＲＮＡ／　３２４载体的干扰组ＬｏＶｏ细胞从１２　ｈ开始迁移能力明显减弱ｆ尸＜　

０．０５）。　３讨论　

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，大肠癌的治疗主要以手术　切除为主，化放疗为辅，虽然短期效果明显，但毒副反应巨大，患　者需承受巨大痛苦，且复发率高，尤其对于已转移患者，远期疗　

效差。因新的治疗机制及手段亟待发现Ｉ　Ｉ。　ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路与肿瘤发生发展密切相关，在许多肿瘤　中ＩＡ型ＰＩ３Ｋ的催化产物ＰＩ（３，４，５）Ｐ３可激活信号传递的下游　

效应分子．引起肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。ＩＡ型ＰＩ３Ｋ　是由ｐＳ５ａ／［３、ｐ５５＂／通过选择剪切产生的７种异构体（调节亚基）　

和ｐｌｌＯａｌ￣１８１＂ｙ（催化亚基１构成的异二聚体，ｐ８５调节亚基能够　有效稳定ｐ１１　０催化亚基，且对ＩＡ型ＰＩ３Ｋ的激活也是必要的　。　ｐ８５ｅ￣是ＰＩ３Ｋ中表达量最高的一种调节亚基，自从有研究表明　

ｐ８５ｏｔ突变可激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路，从而进一步证实ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａｃ￣　（下转第３０页）

　２０１２　Ｎ０　２３　ｉ　ｌＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　

表２两组患儿２８　ｄＮＢＮＡ评分与ＤＱ值的关系　

症的重要原因［５－Ｎ。而早期的诊断和干预是预防脑损伤神经系统　后遗症的重要原因，但是目前对于早产儿脑发育评估的技术多　

采用影像学检验方法和脑功能检查技术等，其中影像学检查侧　

重脑结构的改变，而缺乏早产儿脑功能的相关数据．而现有早产　

儿脑功能检查技术对观测者要求高，结果分析较复杂，ｌ临床应用　

推广困难．因此寻求一种较为简单便可靠的临床检查方法具有　

重要的临床价值。　

ＮＢＮＡ评分法已广泛应用于足月儿的神经行为能力测查　但　

在早产儿神经系统发育及损伤的评价方面报道研究较少，为此　

该研究对１３６例早产儿进行了ＮＢＮＡ评分法评估，并且该研究排　

除先天畸形，严重的神经以外的并发症等干扰因素以确定研究　

的可靠性。并且该研究根据早产儿是否具有脑损伤的危险因素　

将患儿分为具有高危凶素的病例组和无高危因素的对照组．结　

果比较两组ＮＢＮＡ评分法发现病例组早产儿在３、７、１４、２８　ｄ评　

分均低于对照组，差异有统计学意义ｆＰｌ＜０．０５），并且２８　ｄ评分≤　３５分早产儿在３、６、９个月时的ＤＱ值异常率明显高于评分＞３５　分早产儿．因为早产儿的神经行为受先天和后天的双重影响。胎　

儿期高危因素均有可能引起脑缺血、缺氧造成脑损伤，导致新生　临床医学　

儿行为神经改变，而该研究显示具有脑损伤高危因素的早产　儿ＮＢＮＡ评分均明显高于无高危因素的患儿，这说明ＮＢＮＡ评　分能准确的反应早产儿脑损伤，并且该研究经过对评分≤３５分　

的早产儿经过９个月的随访后发现ＮＢＮＡ评分低的早产儿ＤＱ　值异常率明显高于评分＞３５分的早产儿，说明ＮＢＮＡ评分不但能　反应脑损伤情况，而且可以对远期脑发育情况进行预测。　

综上所述，该研究ＮＢＮＡ评分在早产儿中进行应用能准确　的早产儿脑损伤，并且能对远期预后进行评估，并且ＮＢＮＡ评分　操作简单需要技术含量较低，因此值得在临床广泛推广应用。　

［参考文献】　【ｌ】Ｙｅ　Ｇ，Ｊｉａｎｇ　Ｚ，Ｌｕ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｉｎｆａｎｔｓ　ｂｏｒｎ　ａｌｔｅｒ　ｐｒｅｔｅｒｍ　ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｒｕｐｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｗｉｔｈ　２４－３４　ｗｅｅｋｓ　ｏｆ　ｇｅｓｔａｔｉｏｎ：ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　ｃａｒｅ　ｕｎｉｔ　ｓｔａｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｍａｔｅｒｎ　Ｆｅｔａｌ　Ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｍｅｄ，２０１１，２４（７）：９６０－９６５．　［２］ｌＪｉ　Ｙ，Ｘｕ　Ｘ，Ｗｕ　Ｋ，Ｃｈｅｎ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆｌｅａｄ　ｌｏａｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｓｃｏｒｅｓ　ｉｎ　Ｇｕｉｙｕ，ａｎ　ｅｌｅｅｔｒｏｆｉｉｅ　ｗａｓｔｅ　ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ　ｔｏｗｎ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｏｎｉｔ，２００８，１０　（１０）：１２３３—１２３８．　［３］鲍秀兰．０￣３岁儿童最佳的人生开端【Ｍ］．北京：中国发展出版社，２００５：　

３２９－３４１．　【４】王爱平，孙雯，白妙琴．新生儿行为神经测定对足月高危儿预后评估［Ｊ】．　医药论坛杂志，２００７，２８（７）：８－９．　Ｉ５】刘敬，贺继文，王琪．早产儿脑室周围一脑室内出血发生率调查及高危　因素分析［ＪＩ．中华儿科杂志，２００５，４３（３）：２１６—２１７．　【６】韩玉昆．早产儿脑室周围／脑室内出血及其防治【Ｊ】．小儿急救医学，　２００４，ｌ　１（４）：２１０－２１２．　（收稿日期：２０１２—０７—０３）　

（上接第２８页）　

为癌基因以来，就陆续发现在许多癌组织中存在ｐ８５ｏＬ基因　的突变。但是将ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａａ基因干扰掉，同时检测其是否通　

过激活下游ＦＯＸＯ转录因子家族来调控大肠癌细胞的生存及　

凋亡，国内外均未见报道。该实验首次利用ＲＮＡ沉默ＰＩ３Ｋ　

Ｄ８５ａ用于对大肠癌治疗意义的研究，在体外检测转染后细胞　

增殖和细胞凋　的变化，探讨干扰ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｏＬ后是否通过激　

活下游的ＦＯＸ０转录因子来实现对上述变化的调控，并且在　

体内检测转染后细胞成瘤能力的大小，在组织水平检测ＰＩ３Ｋ　

Ｄ８５　在正常大肠上皮组织、大肠腺瘤、大肠癌中的变化趋势，　

以此为发现大肠癌基因治疗新的靶点提供理论依据。　

该组中，体外划痕研究发现，与阴性对照组比较，转染　

ｓｈＲＮＡ／３２４载体的干扰组ＬｏＶｏ细胞从１２　ｈ开始迁移能力明显　

减弱（尸＜０．０５）。进一步证实，因ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ａ异常引起的肿瘤细胞　

运动力增强是导致大肠癌转移的重要机理。总之，本组研究表　

明．ＲＮＡ干扰靶向可有效抑制ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｅ￣蛋白表达，降低肿瘤细　

３０　中夕　医疗ＣＨＩＮＡ　ＦＯＲＥＩＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　胞的运动转移能力，这对加深科研人员及ｌ临床医生对ＰＩ３Ｋ　ｐ８５ｏＬ　的认识．为更加准确预测转移复发及开发新的基因治疗方法具　

有重要意义。　

【参考文献】　［１］Ｖｉｖａｎｃｏ　Ｉ，Ｓａｗｙｅｒｓ　ＣＬ．Ｔｈｅ　ｐｈｏ　ｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔ０ｌ３一Ｋｉｎａｓｅ　ＡＫＴ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｎａｆ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ　２００２，２：４８９－５０１．　［２１　Ｗａｒｄ　ＳＧ，Ｆｉｎａｎ　Ｐ．Ｉｓｏｆｏｒｍ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　３一ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ。　ｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｓ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｕｎ＂Ｏｐｉｎ　Ｐｉｚａｒｍａｅｏｌ　２００３，３：４２６—　４３４．　ｆ３］Ｓｏｌｉｔ　ＤＢ，Ｂａｓｓｏ　ＡＤ，Ｏｌｓｈｅｎ　ＡＢ，Ｓｃｈｅｒ　ＨＩ，Ｒｏｓｅｎ　Ｎ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　９０　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｄｏｗｎ——ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　Ａｋｔ　ｋｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ　ｔｕ—　ｍｏｌｓ　ｔｏ　Ｔａｘｏｌ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００３：６３：２１３９—２１４４．　ｔ４１　Ｚｈｅｎｇ　Ｗ，Ｋａｒ　Ｓ，Ｑｕｉｒｉｏｎ　Ｒ，ｅａ　ａＩ．Ｉｎｓｕｌｉｎ—ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ一１一ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｆａｍｉｌｙ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＦＫＨＲＬＩ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｋｔ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ＰＣ１２　ｃｅｌｌｓ【Ｊ１．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２０００，２７５：　３９１５２—３９ｌ５８．　（收稿日期：２０１２—０７—０３）

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RNA干扰CD151基因表达抑制肝癌细胞侵袭

RNA干扰CD151基因表达抑制肝癌细胞侵袭

第２３卷第２期　２０１４年４月　中国组织化学与细胞化学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　０Ｆ　Ｙ　ＡＮＤ　ＣＹＴ０ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＶｏＩ＿２３．ＮＯ．２　Ａｐｒｉｌ．２０１４　ＲＮＡ干扰ＣＤ１５１基因表达抑制肝癌细胞侵袭　李鹏程　秦　谨　邹远林　左后娟　刘正湘　（华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科，武汉４３００３０）　［摘要］　目的研究ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡｉ）抑制ＣＤ１５１表达对人类肝癌细胞迁移侵袭的影响及分子机　制。方法将ＣＤ１５１一ｓｉＲＮＡ在脂质体介导下瞬时转入人肝癌ＨｅｐＧ２细胞，倒置荧光显微镜观察转染效率，用ｑＰＣＲ，ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ＨｅｐＧ２细胞ＣＤ１５１　ｍＲＮＡ和蛋白表达，体外研究肿瘤细胞迁移和侵袭能力，并检测相关信号通路的变化。结果　成功转染ＣＤ１５１一ｓｉＲＮＡ后，ＨｅｐＧ２细胞ＣＤ１５１基因的表达与正常对照组和阴性对照组相比，ｍＲＮＡ和蛋白表达水平明显降　低（Ｐ＜０．０５），细胞迁移和侵袭能力明显下降（Ｐ＜０．０５），同时，沉默ＣＤ１５１的表达，ＦＡＫ，ＥＲＫ的磷酸化受抑制。结论　ＣＤ１５１一ｓｉＲＮＡ能有效抑制人肝癌细胞ＣＤ１５１基因ｍＲＮＡ和蛋白的表达，通过抑制ＦＡＫ，ＥＲＫ蛋白的磷酸化水平，降低细胞　的迁移和侵袭力。　（关键词］ＲＮＡ干扰；　（中图分类号］Ｒ７３５．７　ＣＤ１５１；肝癌细胞；侵袭；　（文献标识码）Ａ　分子机制　ＤＯＩ：１０．３８７０／ｚｇｚｚｈｘ．２０１４．０２．００１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣＤ１５１　Ｇｅｎｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｉＲＮＡ　ｏｎ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ　Ｌｉ　Ｐｅｎｇｃｈｅｎｇ　，Ｑｉｎ　Ｊｉｎ，Ｚｏｕ　Ｙｕａｎｌｉｎ，Ｚｕｏ　Ｈｏｕｊ　ｕａｎ　，Ｌｉｕ　Ｚｈｅｎｇｘｉａｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＴｏｎｇＪｉ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊ　ｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００３０，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣＤ１５１－ｓｉＲＮＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１５１　ｇｅｎｅ，ｃｅｌｌ　ｍｅ—　ｔａｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ＨｅＤＧ２　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ，ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ．Ｍｅｔｈ—　ｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ０ｔｉｄｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ｏｆ　ＣＤ１　５　１一ｓｉＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＰ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｉＲＮＡ　ｗｉｔｈ　ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｏｒ—　ｄｅｒ，ｈｅｎｃｅ　ｎｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＣＤ１　５　１　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｑＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｗｏｕｎｄ　ｃｌｏｓｕｒｅ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　ｃｈａｍｂｅｒ　ａｓｓａｙ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎ—　ｖａｓｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｖｉａ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ　Ｔｈｅ　ｔｏｔａ１　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＣＤ１　５　１　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＤ１　５　１－ｓｉＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．Ｏ５）．Ｔｈｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｂｉｌｉ—　ｔｙ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ＣＤ１　５　１一ｓｉＲＮＡ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ＣＤ１　５　１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｎ　ａｌｓｏ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ＦＡＫ—ＥＲＫ　ｐｈｏｓ—　ｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣＤ１　５　１　ｉｎ　ＨｅｐＧ２　ｅｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ＣＤ１　５　１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｗｈｉｃｈ　ｗｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｓｔｒａｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｉｌｓ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ＦＡＫ—ＥＲＫ　ｐａｔｈｗａｙｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；　ＣＤ１　５　１；ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ；　Ｉｎｖａｓｉｏｎ；　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　原发性肝癌是严重危害人类健康的一类疾病，其　发病率高、起病隐匿、进展迅速、恶性程度高、治疗困　难，多数肝癌患者在被确诊时已是中晚期，失去了治疗　的机会。我国是原发性肝癌的高发区。如何阻断肝癌　的侵袭和转移是目前肝癌治疗的焦点。肿瘤的基因治　［收稿日期］２０１３—１１一Ｏ４［修回日期］２０１４－０２—２０　（基金项目］国家自然科学基金资助（８１００００４７，８１０００１３９）　［作者简介］李鹏程，女（１９８６年），汉族，博士研究生。　＊通讯作者（Ｔｏ　ｗｈｏｍ　ｃｏｒｒｅｓｐ０ｎｄｅｎｃｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）　疗，无论是在基础研究还是临床研究中，一直以来都是　备受关注的热点问题。本研究旨在探讨ＲＮＡ干扰技　术沉默人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞ＣＤ１５１基因的表达，　对肝癌细胞体外迁移和侵袭的影响。　材料和方法　１．材料　１．１细胞株　人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２购自武汉大学物种保藏　中心。

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

顾靓;张阳德

【期刊名称】《中国医药导报》

【年(卷),期】2011(8)6

【摘 要】目的:探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞侵袭与转移的影响.方法:体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞24h,同时设无义对照组(转染无义对照siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用Transwell小室细胞体外实验检测转染后肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数,评价肝癌细胞体外侵袭和转移能力的变化.结果:mTOR siRNA转染组HepG2细胞mToR蛋白的表达低于各对照组(P<0.05);HepG2细胞侵袭和转移力均显著低于各对照组(P<0.05).结论:mTOR siRNA可有效抑制HepG2细胞mTOR蛋白的表达,且能抑制HepG2细胞的侵袭和迁移.%Objective: To study the effect of mTOR siRNA

on the expression of mTOR gene, cell invasion and metastasis of human

Hepatoma HepC2 cell.Methods: The oligonucleotide templates of mTOR

siRNA were designed primarily, then were used to transfect HepG2 with 24

h, and the control groups were established accordingly by using siRNA

with insignificant order, liposome only and no transfection.The level af

RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响

RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响

第１８卷第４期　２００８年７月　江苏大学学报（医学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｖｏ１．１８　ＮＯ．４　Ｊｕ１．２００８　

ＲＮＡｉ沉默ＶＥＧＦ表达对大肠癌细胞肝转移的影响　

王崇强　，范钰　，徐永中。，庞利群　

（１．江苏大学附属医院消化科。江苏镇江２１２００１；２．江苏大学附属人民医院肿瘤研究所。江苏镇江２１２００２；３．江苏大学附属医院检　验科，江苏镇江２１２００１；４．江苏大学附属医院普外科，江苏镇江２１２００１）　

［摘要］　目的：研究血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）对大肠癌肝转移的影响。方法：根　据ＶＥＧＦ基因ｍＲＮＡ设计合成小干扰ＲＮＡ，采用荧光实时定量ＰＣＲ检测ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ水平，分别以软琼脂集落培养　试验和Ｂｏｙｄｅｎ模型观察癌细胞锚着不依赖性增殖和癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立大肠癌肝转移模型，以不同方　法处理的癌细胞接种模型，观察对大肠癌细胞肝转移的影响。结果：转染组ＶＥＧＦ基因ｍＲＮＡ水平明显降低，且呈浓　度和时间依赖性。经ＶＥＧＦ　ｓｉＲＮＡ转染处理的癌细胞软琼脂集落形成数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性（Ｐ　＜０．０５，Ｐ＜０．０５）。体内试验发现，对照组１０只全部出现大肠癌肝转移灶，而ｓｉＲＮＡ组仅仅１只出现肝转移，差异具　有显著统计学意义（Ｐ＜０．０１）。结论：ＶＥＧＦ基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用；以ＲＮＡｉ技术沉默ＶＥＧＦ基因　表达，可抑制大肠癌细胞肝转移。　［关键词］肠肿瘤；肝转移；血管内皮生长因子；ＲＮＡ干扰　［中图分类号］Ｒ７３５．３　［文献标志码］Ａ　［文章编号］１６７１—７７８３（２００８）０４—０２９１—０４　

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　

RNAi沉默Plk1对胰腺癌细胞系AsPC-1侵袭转移的影响

RNAi沉默Plk1对胰腺癌细胞系AsPC-1侵袭转移的影响

论　著　

ＲＮＡｉ沉默Ｐｌｋｌ　中国医药导报２０１３年ｌ２月第ｌ０卷第３５期　

对胰腺癌细胞系ＡｓＰＣ－１侵袭转移的影响　

喻春钊　余翔　王兴伟　骆霞岗　李　泉　竺　慧　王伟林　

南京医科大学第二附属医院普通外科．江苏南京２１００１１　

【摘要】目的探讨ＲＮＡｉ沉默Ｐｌｋ１基因表达与胰腺癌细胞侵袭转移能力的关系。方法根据Ｐｌｋ１基因特点，设计并用　

化学方法合成了４个小干扰核糖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）（ｓｈｐｌｋｌ一１、ｓｈｐｌｋｌ一２、ｓｈｐｌｋ１—３、ｓｈｐｌｋｌ一４），脂质体转染法将短链　

ｓｉＲＮＡ转入ＡｓＰＣ—ｌ细胞；细胞分为：未处理组为对照组、空质粒组、ｓｈｐｌｋｌ一１组、ｓｈｐｌｋｌ一２组、ｓｈｐｌｋ１—３组、ｓｈｐｌｋｌ一４组。　采用ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测ｓｉＲＮＡ对Ｐ１ｋ１表达的抑制效果；采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测转染后细胞侵袭能力：采用　

划痕实验检测转然后细胞迁移能力。结果ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果示所设计的４个ｓｉＲＮＡ均能明显抑制ＡｓＰＣ—ｌ　

细胞Ｐｌｋ１　ｍＲＮＡ水平，以ｓｈｐｌｋｌ一３效果最好，与对照组、空质粒组及其他三组比较，转染ｓｈｐｌｋｌ一３组Ｐｌｋｌ　ｍＲＮＡ和蛋　白的表达水平显著降低（Ｐ＜０．０１）；以转染ｓｈｐｌｋｌ一３处理ＡｓＰＣ一１细胞后与对照组、空质粒组比较，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验　证实：细胞转染２４　ｈ后，正常对照组、空质粒组和ｓｈｐｌｋＩ一３组穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为（１９５￣１６）、（１７６￣　

１３）、（８３￣５）个，侵袭能力明显降低，差异有高度统计学意义（Ｐ＜０．０１）；细胞划痕实验证实：ｓｈｐｌｋｌ一３组迁移能力明显降　低。结论抑制胰腺癌细胞Ｐ１ｋ１基因，侵袭迁移能力明显降低，能够为胰腺癌的治疗提供新的策略。　

【关键词］Ｐｌｋｌ；ｌ：ｋＮＡｉ；胰腺癌；侵袭；转移　

【中图分类号】Ｒ７３５．９　【文献标识码］Ａ　【文章编号】１６７３—７２１０（２０１３）１２（ｂ）一０００４—０４