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奶山羊乳房炎病原菌分离鉴定与药敏检测分析郭东芳新乡县动物检疫站，河南新乡 453700摘 要：[目的]调查新乡县奶山羊乳房炎病原菌和耐药性。
[方法]对患乳房炎奶山羊283 份乳汁病料进行病原菌分离培养、生化试验，利用细菌16S rRNA通用引物PCR扩增，采用Kirby-Bauer纸片法对致病菌进行9 种抗生素耐药性检测分析。
[结果]共分离鉴定出92 株致病菌，其中，23 株为金黄色葡萄球菌，占25.0%；11 株为无乳链球菌，占11.96%；4 株为化脓链球菌，占4.35%；12 株为乳房链球菌，占13.04%；17 株为大肠埃希氏菌，占18.48%；25 株为其他菌株，占27.17%。
致病菌对9 种抗生素产生不同程度耐药性，金黄色葡萄球菌对阿莫西林、克林霉素、头孢哌酮、红霉素的耐药率分别为65.22%、69.56%、69.57%、60.87%，链球菌对卡那霉素耐药率为81.48%，大肠埃希氏菌对克林霉素、卡那霉素耐药率为70.59%、76.47%。
[结论]金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希氏菌是奶山羊乳房炎主要致病菌，致病菌株耐药性较严重。
关键词：奶山羊；乳房炎；病原菌；分离鉴定；耐药性文章编号：1671-4393（2023）10-0067-05 DOI:10.12377/1671-4393.23.10.120 引言奶山羊乳房炎是由多种病原微生物引起的乳腺组织炎症，临床型乳房炎表现为乳腺组织红、肿、热、疼，亚临床型乳房炎无明显症状，但两者都降低奶产量，改变乳汁成分，破坏乳制品的卫生和营养价值，给奶山羊养殖场造成严重经济损失。
细菌是导致奶山羊感染乳房炎的主要致病因素，主要包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、乳房链球菌（Streptococcus uberis，S.uberis）和大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）等致病菌，占致病菌的80%～90%[1~4]，其他细菌也是不可忽视的致病因子。
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
肠球菌属细菌对抗菌药物的耐药性分析杨其军【摘要】目的了解肠球菌对常用抗菌药物的耐药性特点.方法对临床标本中分离出的细菌进行系统检验,采用 K-B纸片法对分离鉴定后的肠球菌进行药物敏感性试验.结果屎肠球菌对青霉素类、呋喃妥因、喹诺酮类、高浓度庆大霉素、红霉素和利福平的耐药性明显高于粪肠球菌,而对四环素类抗菌药物、高浓度链霉素和氟霉素的耐药性则低于粪肠球菌;万古霉素和替考拉宁是敏感性最高的抗菌药物.绪论临床医师应关注临床常见病原菌的耐药性,动态监测肠球菌的耐药状况对于指导临床治疗具有重要意义.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2010(019)017【总页数】2页(P9-10)【关键词】肠球菌;药物敏感性试验;耐药性;合理用药【作者】杨其军【作者单位】浙江省诸暨市中医院药剂科,浙江,绍兴,311800【正文语种】中文【中图分类】R969.3;R978;R915肠球菌的感染主要发生于长期住院、患有严重基础疾病、免疫功能抑制、老年和大量使用广谱抗菌药物尤其是头孢菌素的患者。
肠球菌细胞壁坚厚，对许多抗菌药物表现为固有耐药，对临床常用的抗菌药物耐药性不断增加，因此作为医院感染的常见病原菌越来越受到关注。
笔者根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）建议，选择青霉素类、四环素类、喹诺酮类、糖肽类、大环内酯类、硝基呋喃类和高浓度氨基苷类等18种抗菌药物，对2007年1月至2009年12月本院临床分离的粪肠球菌156株、屎肠球菌75株共231株肠球菌进行了药物敏感试验，现报道如下。
1 材料与方法药敏M-H培养基、Vitek-32型全自动细菌鉴定仪均为法国生物梅里埃公司产品；药敏纸片为英国Oxoid公司产品。
231株肠球菌菌株取自2007年1月至2009年12月我院住院及门诊患者送培养的标本，包括156株粪肠球菌和75株屎肠球菌。
标准菌株ATCC 29212，ATCC 25922，ATCC 25923，ATCC 23857，ATCC 700603均购于卫生部临床检验中心。
抗菌药物敏感性实验与细节耐药性监测来源：查验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感实验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer实验，是操作最简易、利用最普遍的抗菌药物敏感性实验。
1．实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。
2．培育基和抗菌药物纸片(1)培育基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培育基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培育基，pH值为～，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配制琼脂平板当天利用或置塑料密封袋中4℃保留，利用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方式使每片含量达到规定所示。
含药纸片密封贮存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保留，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过l周。
利用前将贮存容器移至室温平衡l～2h，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方式。
用麦氏比浊标准的菌液浓度。
校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。
接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感实验结果应孵育24h。
目录2.1菌株的分离纯化 (1)2.1.1菌株的分离 (1)2.1.2菌株的纯化 (1)2.2菌株的鉴定 (2)2.2.1革兰氏染色镜检 (2)2.2.2菌株的生化鉴定 (2)2.3药敏试验 (3)2.3.1药物的配制 (3)2.3.2质控 (4)2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (5)2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7)2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7)2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7)2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)2.1菌株的分离纯化2.1.1菌株的分离2.1.1.1实验的准备1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管（1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁；（2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡；（3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz；（4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz；（5）倒出管中水，重复（4）一次；（6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干；（7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min；（8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。
2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。
注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。
3.试管的准备：本实验需要100根试管（1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁；（2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压；（3）取出后烘干待用。
4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。
5.麦康凯琼脂培养基的准备：按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。
兽用链霉素的功能主治1. 概述链霉素是一种广谱抗生素，属于大环内酯类抗生素，对于很多细菌引起的感染具有很好的疗效。
在兽医领域，链霉素被广泛用于畜禽养殖中，以预防和治疗动物感染性疾病。
本文将介绍兽用链霉素的功能主治。
2. 功能主治2.1 非特异性感染链霉素可以用于治疗非特异性感染，如呼吸道感染、泌尿道感染等。
它能有效地抑制细菌的生长和繁殖，从而减轻动物的感染症状，加速康复。
2.2 肠道感染链霉素也可以用于治疗肠道感染，如大肠杆菌感染、沙门菌感染等。
它能够通过抑制细菌的蛋白质合成，从而阻止细菌的繁殖，减少炎症反应，缓解腹泻等症状。
2.3 皮肤和软组织感染链霉素在治疗皮肤和软组织感染方面也具有显著的效果。
它可以通过抑制细菌的生长，减少感染的蔓延，加速伤口愈合和炎症的缓解。
2.4 泌尿系统感染链霉素还可以用于治疗泌尿系统感染，如尿道感染、膀胱炎等。
它能够通过抑制细菌蛋白质的合成，从而阻止细菌的繁殖，减轻感染症状，加速康复。
2.5 预防和控制感染链霉素除了治疗感染外，还可以用于预防和控制感染的发生。
在动物养殖过程中，适当使用链霉素可以阻止细菌的繁殖，减少感染的风险，从而提高养殖动物的生产效益。
3. 使用注意事项使用链霉素时需要注意以下事项：•必须遵循兽医师的指导，按照正确的剂量和使用方法使用链霉素。
•链霉素不宜长期使用，以免产生细菌耐药性。
•对于过敏体质动物、孕妇动物、幼仔动物等特殊群体，应慎用链霉素。
•使用链霉素期间，应定期检查动物的肝功能和肾功能，确保用药安全性。
4. 总结兽用链霉素是一种有效的抗生素，广泛应用于畜禽养殖中。
它的功能主治包括非特异性感染、肠道感染、皮肤和软组织感染、泌尿系统感染以及预防和控制感染等。
在使用链霉素时，需要注意使用剂量、使用方法以及注意事项，以确保用药的安全性和疗效。
链霉素耐药细菌的分离及鉴定摘要：本实验对江和河道水源中链霉素耐药细菌的分离及鉴定，判断水体的链霉素污染情况。
实验先通过含链霉素及不含链霉素的LB固体培养基培养、计数、筛选有耐药性的细菌，再采用连续梯度稀释法纯化、16S rDNA扩增法进行分子鉴定，完成对耐药菌初步鉴定。
实验结论对预防和减缓水源耐药性细菌问题，为以后耐药性机制的研究及寻找新型抗生素积累菌种资源有重要意义。
关键词：链霉素耐药细菌分离鉴定链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，属于氨基糖甙碱性化合物，分子式C21H39N7O12。
链霉素能与30s亚基结合并影响蛋白质合成的多个环节从而起到杀菌的作用。
其结构为一分子链霉素胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷。
链霉素为白色无定形粉末，在酸性条件下可以水解成链霉胍和链霉双糖胺，进一步水解可得到N-甲基-L-葡萄糖胺。
在弱碱性情况下也可以水解得到链霉胍和链霉双糖胺，但进一步水解即将链霉糖部分重排为麦芽酚，麦芽酚可以跟Fe3+反应生成紫红色配合物，这是链霉素的特有反应，可用于其鉴别，亦可用作含量测定。
链霉素分子中还有醛基，可以被氧化剂氧化而降低抗菌活性。
细菌耐药性也称细菌抗药性，是指细菌能抵御抗生素影响的能力。
细菌耐药性按传统的分类方法分为固有耐药性和获得耐药性。
固有耐药性也叫做天然耐药性，是细菌对抗菌药的天然不敏感，由于具有这种特点的细菌不具有药物的作用靶点而产生耐药性。
获得耐药性是细菌在长期接触抗菌药物情况下发生变异，从而获得耐药性。
这种耐药性包括交叉耐药性、单向耐药性和多重耐药性。
细菌获得耐药性发生的机制可分为遗传学机制和生化机制。
目前由于大量地使用链霉素，导致链霉素在一些食品和生物体中有残留。
含链霉素废水排入天然水体中，是链霉素的存在于自然环境中的关键原因。
链霉素的残留又是导致耐药细菌产生的重要原因，所以必须对环境、农产品和食品中链霉素残留量进行检测，避免链霉素通过食物链在某一生物体内积累。
1 材料和方法1.1材料1.1．1 耗材离心管（1.5ml）、PCR 扩增管（0.2ml）、枪头（10μl、200μl、1ml）、1.5ml离心管盒、45mm过滤器、0.25μm 滤膜等。
1.1.2 仪器和试剂移夜枪、pH计、培养箱、H1650电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）、高速离心离心机、PCR仪（PTC100，MJ 公司）蛋白胨、酵母浸膏、链霉素（Genview）、16S rDNA引物（F27、R1492，上海英骏生物技术有限公司）、Taq酶（上海申能博彩）等2 方法2.1 预处理培养皿、试管、移液枪枪头、过滤器等的灭菌；LB 培养的配制；链霉素（1.6 mg/ml）的配制；抗生素平板的制备，将灭好菌的装有50ml LB固体培养基的三角瓶放入60℃水浴锅中，在水浴锅中保温半小时，使培养基的温度不超过50℃，然后取出三角瓶，加入链霉素（0.8 mg/ml）225μl，摇匀，于无菌台上倒平板，每个平板所加的培养基约为15ml，平板倒好冷却后，立即放入避光环境下。
37℃培养箱中放置过夜。
2.2 耐药性菌株的筛选从R1河流及R2河流中取得水样，取200μl水样涂布在含抗生素的平板上，另将原水样稀释成10-1和10-2，分别取100μl涂布在不含抗生素的平板上作对照，平衡涂布3个平板，置于37℃培养箱中培养24h。
第二天观察并计录单菌落数，同时计算细菌的耐药率。
并从含抗生素平板上挑取菌落比较特殊的单菌落进行下一步的纯化鉴定。
2.3 耐药性细菌菌株的纯化及保藏对所挑取的耐药性细菌菌株采用梯度稀释法进行纯化。
用无菌的接种环将挑取的单菌落接到含有0.5ml LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡混匀后，作为原液，然后进行10倍的稀释至10-4和10-5，取这两个稀释度的悬浮液100μl涂布在固体培养基上，置于37℃培养箱中培养24h。
重复三次。
培养得到单菌落，对单菌落进行观察并记录菌落形态和大小，并接种到3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床中，200rpm，振荡培养24h。
取无菌的1.5ml离心管于离心管盒中，在管盖上标上抗生素、菌株编号和日期。
用200μl移液枪吸取200μl 50%甘油到1.5ml离心管中，再加入800μl上述菌液到离心管中，颠倒混匀，于-20℃冰箱中保存。
2.4 耐药性细菌菌株的MIC测定配制链霉素浓度梯度的LB液体培养基：0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml，分别接种10μl上述纯化得到的细菌的菌液，于37℃摇床中，200rpm，振荡培养24h，第二天观察细菌生长情况，以在试管内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
2.5 革兰氏染色革兰氏染色及镜检涂片干燥、加热固定冷却结晶紫初染、碘液媒染酒精脱色番红复染、干燥镜检。
2.6 16S rDNA序列扩增及分析2.6.1 将上述得到的纯种接种至LB液体培养基中培养过夜，取100μl菌液至无菌1.5ml离心管中，以10000rpm离心2min，用枪吸去上清夜；加入100μl的无菌水，振荡重悬菌体，于100℃水浴锅中煮10min以破壁，冷却至室温后以12000rpm离心2min，吸取50μl 上清夜至另一个无菌的离心管中作为16S rDNA扩增的DNA模板。
采用细菌16S rDNA通用引物F27（5´- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3´）及R1492（5´- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3´），按以下反应体系进行PCR：PCR 程序：94℃，3 min94℃，45 sec58℃，45 sec72℃，90 sec，30 cycles72℃，10 min10℃，10min10×PCR buffer5μldNTPs4μlF27 引物（10pmol/μl）2μlR1492 引物（10pmol/μl）2μlDNA 模板2μlrTaq（5U/μl）0.3μlddH2O34.7μlTotal 50μl2.6.2 凝胶电泳：吸取PCR扩增产物5μl与1μl 6×loading buffer 混合，上样至凝胶的小孔上（负极），接上电源，电泳60min，电压为120伏。
电泳完后，将凝胶取出放入溴化乙锭液中，浸泡15min，取出凝胶放入凝胶成像仪中进行凝胶成像。
2.7 16S rDNA的测序及序列分析将扩增产物直接送到上海英骏测序公司进行测序，测序结果使用phrap（V0.990329）拼接，去掉两端低质量序列（质量低于40），将得到的16S rDNA序列用blastn（2.2.14）比对NCBI的核酸数据库（/BLAST/）。
3 结果3.1耐链霉素细菌分离结果从河流R1及R2采集水样进行耐链霉素细菌的分离，参考美国标准委员会（NCCLS）2004年的标准，介定耐链霉素细菌的最低抑制浓度为10?g/ml，结果表明两河流水样都能筛选到耐链霉素的菌株，其中R1水样的可培养细菌的耐药率为0.167%，而R2的可培养细菌的耐药率为0.119%。
此外R1河道的3次采样中，各次空白对照的可培养的细菌数在105左右，3次平均值为1.32×105，R2的可培养的细菌数在104左右，3次平均值为2.1×104，只有R1细菌数平均值的7/44。
从含链霉素抗生素的LB固体培养基平板上随机挑取了一株细菌，经过梯度稀释法纯化，得到的纯种编号为Sm5，其中Sm是链霉素的英文缩写。
细菌大小形状颜色透明度湿度表面Sm51.1mm圆形白色不透明湿润凸起3.3 Sm5的MIC测定结果对两株耐链霉素细菌进行链霉素最低抑制浓度（MIC）测定，结果Sm5能够在链霉素浓度0～80μg/ml的LB液体培养基生长，但在链霉素浓度160μg/ml的LB液体培养基不生长，因此Sm5的最低抑制浓度MIC为160μg/ml。
NCCLS对链霉素的MIC标准是10μg/ml，该细菌的MIC是NCCLS标准的16倍，该细菌为强耐药菌株。
表3 进行链霉素最低抑制浓度（MIC）测定结果链霉素浓度(μg/ml)010*********生长状况+++++++-注：++ 生长良好，+ 生长，- 不生长。
3.4 Sm5的革兰氏染色结果Sm5经革兰氏染色后，在40倍数码显微镜下观察细胞呈红色，是革兰氏阴性细菌，它的细胞呈长杆形，长约1.0～2.0μm，宽约0.3～0.5μm。
3.5 Sm5的16S rDNA的扩增结果采用细菌16S rDNA扩增的通用引物F27和R1492进行扩增，Sm5的条带见图2的泳道4，能扩增出1.5kb左右的目的片段。
3.6 Sm5的16S rDNA的测序及序列分析本次实验所得到的Sm5的16S rDNA的扩增目的产物直接送到上海英骏测序公司广州分公司进行纯化并测序，得到的序列峰图杂峰很少，去掉低质量及拼接，所得到的Sm5 16S rDNA的序列长度为1415bp。
把此序列在NCBI的核酸数据库（/BLAST/）进行blast比对分析，blast结果如下：4 结论本实验对中山市区的R1河道及R2进行耐链霉素细菌调查，按照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）的标准（10μg/ml），两处的耐药率分别为0.167%和0.119%。
随机筛选得到一株细菌，记为Sm5，进行MIC检测发现，Sm5的MIC为160μg/ml，是NCCLS标准的16倍，该细菌耐链霉素强。
对Sm5进行了初步鉴定，16S rDNA的测序结果表明它属于Pseudomonas plecoglossicida（革兰氏阴性细菌）。
由于Pseudomonas plecoglossicida是一种鱼类致病菌，可在以后的研究中对它的耐药谱进行检测以及对它的耐药机制进行研究如耐药基因定位等。
因此本实验为今后耐药性机制的研究及寻找新型抗生素积累宝贵的菌种资源。
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