疼痛实验动物模型科研探索2007-04-25 23:11:36 阅读147 评论0 字号：大中小订阅疼痛是机制非常复杂的神经活动。
疼痛研究已经成为当前神经科学研究的重要课题之一。
由于疼痛机制的复杂性，使得在患者身上研究与疼痛有关的神经机制成为不可能的事。
因而，我们的研究需要相应的动物模型。
本章介绍了在现代神经科学研究中常用的疼痛动物模型。
在概要介绍了疼痛研究的意义及其现状之后，重点介绍了在生理痛研究和急性、慢性病理痛研究中所应用的动物模型。
生理痛的模型即常用的动物伤害性感受阈测定法；急性病理痛的模型则主要是各种急性炎症模型模型；慢性病理痛的模型则包括慢性炎症模型和慢性神经损伤模型。
前言疼痛(pain)是人们一生中经常遇到的不愉快的感觉。
它提供躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能。
另一方面，它又是各种疾病最常见的症状，也是当今困扰人类健康最严重的问题之一。
近年来，仅在美国就有三至四千万人患有慢性痛。
据估计，美国每年用于治疗慢性痛的费用约为400~600亿美元；澳大利亚每年用于治疗疼痛的费用占全部医疗费用的40%。
随着医学的进步和人类生活水平的提高，烈性传染病逐渐得到控制，疼痛在人的身心痛苦和医疗费用消耗上的相对地位将越来越重要。
由于难以在人体对疼痛进行深入的机制研究，有必要建立疼痛的动物模型。
但疼痛是是包括性质、强度和程度各不相同的多种感觉的复合，并往往与自主神经系统、运动反应、心理和情绪反应交织在一起，它既不是简单地与躯体某一部分的变化有关，也不是由神经系统某个单一的传导束、神经核和神经递质进行传递的，所以很难将某种客观指标与疼痛直接联系起来。
因而，我们只能根据模型动物对伤害性刺激的保护反应和保护性行为来推测它们的疼痛程度。
伤害性感受(nociception)和痛觉是两个有密切关系但又不相同的概念。
前者是指中枢神经系统对由于伤害性感受器的激活而引起的传入信息的加工和反应，以提供组织损伤的信息；痛觉则是指上升到感觉水平的疼痛感觉。
两者之间有时并没有严格的相关性。
生理痛模型与常用的痛阈测定法概述为了能够对痛觉现象及其机制作深入细致的观察，特别是在中枢神经系统的形态学、细胞生物学和分子生物学水平研究痛觉机制，必须建立动物的痛觉模型。
又由于痛觉是意识水平的感觉，我们无法确定动物是否具有痛觉，只能观察其对伤害性刺激的行为反应。
因而在下文的描述中有时用伤害性感受阈(nociceptive threshold)取代痛阈(pain threshold)。
正常情况下，疼痛是机体对外界伤害性刺激的感受，它是一种报警系统，提示实存的或潜在的组织损伤的可能性。
如果这种伤害性刺激是可以回避的，那么痛觉就是一种具有完全的积极意义的感觉形式，称为生理痛。
这种意义上的疼痛模型实际上就是对伤害性感受阈的测量。
它是通过观察动物对伤害性温度和机械刺激的逃避反应实现的。
如果动物遇到无法逃避的伤害性刺激，就会引起它的情绪反应，发出嘶叫声。
这是需要高级神经中枢配合的反应，并且不受局部运动功能的影响。
因而，在伤害性刺激下引起的嘶叫反应也可以作为伤害性感受阈的测量指标。
热辐射-逃避法这是最常见的伤害性感受阈测量方式。
最常用的有热辐射-甩尾法、热辐射-甩头法和热辐射-抬足法。
热辐射-甩尾法以大鼠为例。
先将大鼠固定在特制的塑料筒中，令其尾部暴露在外并自然下垂，待动物安静20分钟后再予测定。
辐射热源可采用8.75毫米放映灯泡(电压为18.5伏，可调节)，经透镜聚焦后发射出直径约4毫米的光束，照射相当于尾部中、下三分之一交界处的皮肤(光源与尾部皮肤必须紧密相贴)；采用与光源并联的电子计时器同步记录照射持续时间，即当照射开始同时启动秒表，当动物尾部出现明显逃避应时，关闭光源并同时停止计时。
所测得的时间间隔即为甩尾反应潜伏期(Tail-Flick Latency, TFL)。
一般在正式测量之前先调节电压，使TFL值保持在4~6秒左右，然后每5分钟测定一次，取三次测定的平均值作为基础伤害性感受阈。
若动物在镇痛作用下TFL延长至超过15秒，则停止照射并以15秒作为甩尾潜伏期的上限，以免照射过久灼伤皮肤。
用类似的方法也可以在小鼠测定其热辐射-甩尾反应潜伏期。
热辐射-甩头法一般用家兔作为实验对象。
先将家兔用特制的布带悬空吊起，令其四肢自由伸展，并蒙蔽其眼睛。
实验前应用弯剪刀小心剪去口唇部胡须。
待动物安静后，用上述同样的光源照射家兔口唇，等待其明显的逃避反应(将头部移开)。
利用同样的电子计时器测定此反应的潜伏期。
计算方法如上所述。
注意其最长照射时间不要超过10秒。
热辐射-抬足法仍以大鼠为例，将大鼠固定在特制塑料筒中，令其后肢暴露在外。
待动物安静后，用同样的辐射光源照射其后足掌底部；或令大鼠自由站立于玻璃板上，将辐射光源置于玻璃板下，隔玻璃照射足底。
测定其逃避反应(抬足)出现的潜伏期。
以15秒为其最长照射时间的上限。
冷水、热水刺激逃避法实验动物可以是大鼠或小鼠。
刺激部位可以选择尾尖或后足。
将动物适当固定后，令尾尖或后足自然下垂。
待动物安静后，将被刺激部位浸于10°C的冷水或46°C的热水中，记录从开始浸入到被刺激部位逃离水面或出现明显挣扎行为的时间作为伤害性感受阈。
仍以15秒为最长刺激时间的上限。
机械刺激-逃避法又称为Randall-Selitto反应。
一般选用大鼠作为实验动物。
动物置于特制塑料固定筒内，用Randall-Selitto反应测定仪给鼠后足跖部施加以恒定速率连续递增的压力。
当其后足缩回时，即停止加压并读出此时之压力数值(mmHg)，以此压力-缩腿阈(Paw-Withdrawal Threshold, PWT)作为伤害性感受阈。
先测定三次PWT，每次测定间隔5min，取其平均值作为基础阈值；以后测定所得结果均与它比较，并以150%作为PWT升高的上限以免损伤局部组织。
另一种方法是，每次给动物足底施加恒定的压力，记录从开始加压至动物做出逃避反应的时间，以此时间作为伤害性感受阈。
机械刺激-嘶叫法此方法一般以大鼠为实验对象。
采用的固定方法与前节相同，但给予动物不可逃避的刺激，记录动物发出嘶叫时的压力数值(当采用连续递增的压力时)或时间潜伏期(当采用恒定压力时)。
电刺激-嘶叫法本法同样以大鼠为实验对象。
刺激部位可以是尾部或后足。
首先将动物适当固定，并将一对不锈钢针刺激电极插入待测部位(两极间距1cm)，待动物安静后给刺激电极通以频率为50Hz的方波刺激，逐渐增大电流强度，记录动物开始发出嘶叫时的刺激强度，作为其伤害性感受阈。
急性病理性疼痛模型概述当疼痛并非由外部环境原因所致时，疼痛感觉将持续而无法逃避，此时的疼痛就属于病理性疼痛范围。
病理性疼痛按其病程可分为急性和慢性两大类。
前者多由确定的损伤或炎症反应所致，当损伤痊愈或炎症消失时，疼痛即可消除。
后者则多由难以消除的慢性炎症或神经病变所致，病程常迁延很久。
本节将介绍三种急性病理性疼痛模型：模拟腹腔炎症的扭体模型、模拟躯体炎症的福尔马林致痛模型和白陶土-鹿角菜胶炎症模型。
扭体模型本模型可采用小鼠或大鼠。
有多种刺激物都可诱发动物扭体(writhing)行为。
最常见的刺激物是醋酸(acetic acid)。
将1克阿拉伯胶(arabic gum)加入9ml浓度为1%的醋酸溶液中，再注入实验动物体内，观察注射后90分钟期间每15分钟内出现典型扭体症状的次数。
该模型可以模拟腹腔炎症引起的腹痛症状，常用于镇痛药物的筛选。
即观察药物处理组与安慰剂组扭体症状的差别，以确定该药物是否具有镇痛效应以及其剂量-效应曲线。
福尔马林致痛模型本模型的目的是模拟急性组织损伤所致的持续性疼痛。
一般以大鼠为实验对象。
在动物一肢足背皮下注射稀释的福尔马林(formalin)溶液，导致动物的行为改变如安静时的屈腿、运动时的跛行以及舔足等。
这些行为的程度(如舔足时间)与福尔马林浓度成正比，一般认为它是疼痛的象征。
此外，其它行为如理毛、探索和运动活动等也受福尔马林注射的影响。
具体做法如下：将实验动物随机分为若干组，其中福尔马林组在一肢足背皮下注射稀释的福尔马林溶液50ml，浓度在0.1%~10%之间。
对照组动物将注射针刺入同部位注射等体积的生理盐水。
注射后，将动物置于观察笼中，在动物不能察觉的前提下记录其在60分钟内对注射侧和对侧后足的舔足时间。
每隔5分钟计算一次舔足分数(即总舔足时间)。
另外一种评分方法是，按如下的四级评分：0=注射足承担正常重量；1=运动时跛行、休息时足轻触地面；2=注射足抬高，最多用指甲触地；3=出现针对注射足的舔、咬和理毛行为。
必须注意的是，动物应事先训练10天使之适应实验室的环境及手捉等处理。
动物应饲养在恒定的昼夜节律(光照时间)环境中，且观察应当在“暗夜期”在暗红色光线下进行。
本模型的各种症状普遍分为两个时相：前5分钟为第一相，20~60分钟为第二相。
两相均可用于实验，但以第二相为常用。
据认为，使用1.5%的福尔马林剂量加上综合的评分方法具有最强的分辨痛程度的能力。
Clavelou等人新近提出了一种用于面部的福尔马林致痛模型。
他们把不同浓度的福尔马林溶液(0.2~10%)皮下注射到大鼠的右上唇，对照动物则注射盐水。
注射后，立即把动物放在观察箱中观察45分钟。
记录注射后每3分钟时间内动物用同侧前肢或后肢摩擦注射部位的秒数作为痛分数。
注射后动物呈现出类似的两相痛敏。
结果表明浓度在0.5~2.5%之间的福尔马林溶液最有利于观察疼痛强度的变化情况。
白陶土-鹿角菜胶炎症模型本模型的目的是模拟亚急性炎症所引起的疼痛。
白陶土(Kaolin)是一种细颗粒状物质，成分为氧化铝，在此起机械刺激作用；鹿角菜胶(carrageenan)是由水生植物鹿角菜中提取的胶体物质，具有过敏刺激作用。
鹿角菜胶单独实验即可诱发炎症，若与白陶土合并使用，则炎症更为强烈。
可采用家兔或大鼠作为实验对象。
今以大鼠为例。
关节炎的引发分为两步：首先将动物麻醉(可用戊巴比妥钠或水合氯醛)，由一侧后肢足底注入4%白陶土混悬液0.1ml，并按摩5分钟使之在组织中分散。
在第一次注射的1小时后，再注入2%鹿角菜胶溶液0.05ml并按摩5分钟。
以第一次注射的时间作为致炎开始时间。
炎症过程一般在第一次注射后2小时内开始。
动物后足明显红肿，皮温显著升高，PWT值显著降低，呈现类似痛敏的症状。
这些症状一般能持续至第一次注射后12小时以上，24小时后基本复原。
因而本模型属于亚急性炎症痛模型范围。
本模型亦可采用关节腔注射。
此模型适合进行急性药理实验以及比较炎症发作前后变化的电生理实验。
慢性病理性疼痛模型概述临床上持续超过6个月的疼痛即被视为慢性痛。
慢性病理性痛的特征是，疼痛持续时间长，一般均涉及机体的系统性病变(如免疫反应异常或神经系统的异常)。
