基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶

【关键词】肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体

Effects of matrix metalloproteinase9 on the expression of tumor

necrosis factor receptorl in human colon carcinoma cell lines

【Abstract】 AIM: To study the effects of matrix

metalloproteinase9 (MMP9) on the expression of tumor necrosis factor

receptorl (TNFRl) and migratory and invasive potentials in human

colon carcinoma cells. METHODS: Immunofluorescence staining was

applied to examine the expression of TNFRl in SW1116 in human colon

carcinoma cell lines. The expression of TNFRl was assayed by flow

cytometry in human colon carcinoma SW1116 cells treated with iMMP9 at

different concentrations and at different time periods of culture.

RESULTS: TNFRl was expressed in SW1116 cells and MMP9 downregulated

the expression of TNFRl on cell surface in a dose and timedependent

manner. CONCLUSION: MMP9 decreases the expression of TNFRl on the

surface of human colon carcinoma cells, which may be a factor

associated with invasive and metastasis potentials of colon carcinoma.

【Keywords】 intestinal neoplasms; matrix

metalloproteinase; TNFR

【摘要】目的：研究基质金属蛋白酶9 (MMP9)对大肠癌细胞肿瘤坏死

因子受体1 (TNFRl)表达的影响以及促进大肠癌侵袭和转移的可能途径.方法:

通过免疫荧光法研究TNFRl在大肠癌细胞SW1116中的表达；用MMP9干预培养 的大肠癌SW1116细胞，用流式细胞术检测MMP9不同剂量和不同作用时间时

TNFRl表达变化.结果：①SW1116细胞表达TNFR1; @關?9对3化1116细胞表面

TNFRl表达有下调作用，但有剂量和时间依赖性.结论：題?9下调大肠癌细胞

表面TNFRl的表达，可能与大肠癌侵袭转移密切相关.

【关键词】肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体

0引言

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, 了即)是一种主要由单核巨隨细胞

产生的多肽细胞因子，因其在内毒素处理后具有杀伤肿瘤细胞的作用而被命名

为肿瘤坏死因子.TNF的生物学活性是通过存在于细胞表面的膜受体，即肿瘤坏

死因子受体1(如0^«: necrosis factor receptor 1，1即81)和肿瘤坏死因子受

体2(1腿0^: necrosis factor receptor 2，丁即1?2)介导.体内外实验已证实肿

瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR)介导肿瘤坏死因

子的肿瘤杀伤作用，体内有多种免疫活性因子（干扰素、白介素等）即通过激

活上调TNFR以达到清除肿瘤的目的[1 ]，因而诱导并稳定肿瘤细胞膜TNFR对

机体抗肿瘤起非常重要的作用.其他研究还证实大肠癌组织中存在基质金属蛋

白酶（matrix metalloproteinase, MMPs)高表达或活性增强现象.某些活性

基质金属蛋白酶可能通过酶解作用促进肿瘤细胞膜TNFR的释放形成高水平的可

溶性肿瘤坏死因子受体[2] (soluble tumor necrosis factor receptor,

sTNFR),是肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要方式.本研究通过检测1~?“在肿瘤

细胞膜的表达及NMP9对肿瘤细胞膜TNFRl表达的影响，探讨MMP9通过调节

TNFRl促进大肠癌转移的可能机制.

1材料和方法 1. 1材料

大肠癌细胞株（SW1116)由南方医院消化科实验室保存；小牛血清（杭州

四季青生物制品研究所）；RPMI1640培养液，青、链双抗，2.5 8几胰酶丑0

TA (广州威佳生物试剂公司）；鼠抗人了即81单克隆抗体（SantaCruz&

司）；FITC标记的羊抗鼠二抗（武汉博士德公司）；荧光素异硫氰酸盐（FITC)

标记的鼠抗人TNFRl单克隆抗体及重组人MP9购自美国R&D公司；FITC标记

的鼠化01对照抗体（北京鼎国生物有限公司）.

1.2主要仪器倒置、相差显微镜（01ympas&3) •’流式细胞仪（BECTON

DICKINS0N&3).

1.3方法

1. 3. 1细胞培养大肠癌SW1116细胞株为贴壁生长细胞.用RPMI1640培养

基于25现2培养瓶，在371，饱和湿度、50 mL/L 002培养箱中培养，培养基中

含100 mL/L小牛血清，青、链霉素各100 U/mL.汇片后弃培养液，用2. 5 g/L

胰酶丑D T入消化细胞.细胞接种于25 cm2培养瓶，每3 d传代一次.

1.3.2细胞爬片及免疫荧光染色SW1116细胞用2.5 §/1胰蛋白酶消化，用

含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液将细胞调成5父104/‘的细胞悬液，

接种子24孔板中，每孔预先置入6 mmX6 mm盖玻片一张，待细胞生长状态良

好时终止培养.4 8几多聚甲醛固定爬片30化11后0.1 mL/L ?85冲洗，用10

mL/L Triton 乂100处理15 “11后正常羊血清37°0：孵育30 min,甩去血清.滴

加1 : 50稀释的鼠抗人TNFR1单克隆抗体，41湿盒过夜后滴加1 : 100稀释的

?11^标记的羊抗鼠二抗，371：孵育1 h，用蒸馏水振洗后无荧光缓冲甘油封片.

阴性对照用？65代替一抗进行染色.TNFRl阳性表达细胞在荧光显微镜下发出 绿色荧光.

1. 3. 3干预实验人SW1116大肠癌细胞以2父105/虬接种于24孔板，用含

100虬几小牛血清即^01640培养基在371，50 mL/L 002培养箱中培养12 h

使细胞吸附在培养板上换用无血清培养基继续培养24 h后加入MMP9进行干预，

分组如下：®MMP9 0 ng/mL (八组）；@MMP9 154 ng/mL ⑶组）；@NMP9 385

ng/raL (0组）；@MMP9 770 ng/mL (0组）；©MMP9 1155 ng/mL 化组），干

预3 h;然后在MMP9为770 ng/mL的浓度下，分别作用0，1. 5，3，6和9 h.

1. 3. 4流式细胞仪检测大肠癌SW1116细胞TNFRl的表达采用直接免疫荧光

标记法培养细胞制成单细胞悬液并计数，实验管取20 M匕单细胞悬液（含

1父105细胞）与10 M L「11^标记的鼠抗人1斯“单克隆抗体，对照管加入相

应无关鼠对照单抗10 M [在41共育45 min,用含5 g/L 834的等渗？83缓冲

液洗涤细胞两次后弃上清，然后加入400 M L 4 §几的多聚甲醛于41固定30

min,即上机检测.每份样品测定10 000个细胞，计算细胞表达1~?^的百分

率.

统计学处理：各实验独立重复3次，应用3?33 10.0统计软件.数据用

叉土5表示，采用单因素方差分析和0仙阳《1检验的两两比较，？<0.05为有统

计学差异.

2结果

2. 1免疫荧光染色结果TNFRl在SW1116细胞膜呈较强荧光，对照组无表达

(图1).々：5化1116细胞；8:阴性对照.

图ITNFRl在SW1116细胞的表达

2.2不同浓度》 9作用后对TNFRl表达的影响流式细胞检测结果显示，在不同的浓度作用3

h后，与MMP9 0 ng/mL组(表达率90. 92%)比较，MMP9 770 ng/mL组（表达率

69.96%)，MMP9 1155叩/0^组(表达率65.06%) 1即”表达水平明显降低

(P<0. 05) ； MMP9 154 叫/此组（表达率85.05%)，MMP9 385 叩/此组(表达

率87.54%)与響9 0叩/此组相似（P>0.05) ； MMP9 154叩/乩组与國^

385叩/虬组1册81表达水平明显高于腿?9 770 ng/nd^PMMP9 1155 ng/mLS

(P<0. 05) ； MMP9 154叩/虬组与題?9 385邶/虬组1邢町表达水平相似

(P>0. 05) ； MMP9 770叩/虬组和題?9 1155叩/虬间了陬町表达水平相似

(P>0.05,图2).

2. 2MMP

9作用不同时间后对1即^表达的影响在—9 770 1^/仏浓度，不同作用

时间条件下，与0 hm (表达率86.36%)比较，3 h (表达率67.68%)，6 h

(表达率18.08%)，9 h (表达率14.38%)组TNFRl水平明显降低（P<0.05)；

1.5 h (表达率83.88%)组与0匕组1呢幻水平相似（P>0.05) ； 3 hSTNFRl

水平明显高于6 11和9匕组（P<0.05) ； 6 &组与9 &组1见^1水平相似

(P>0. 05,图 3).

aP<0. 05 vs A.

3讨论

TNF在体内外对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，人们曾对TNF治疗肿瘤寄予

很大希望.但由于它在治

疗肿瘤的同时，也对机体产生极其严重的毒副反应,从而影响了它在临床上的广

泛应用.TNF的生物学作用是由二种不同的受体TNFR1 (P55)和11«^2 (P75)