基因工程的基本操作程序(3)

第2节基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取1．培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的筛选与获取。

(2)基因表达载体的构建。

(3)将目的基因导入受体细胞。

(4)目的基因的检测与鉴定。

2．目的基因的筛选与获取目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。

主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。

(1)筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。

(2)利用PCR获取和扩增目的基因①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

②目的：快速扩增目的基因。

③原理：DNA半保留复制。

④基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。

⑤过程a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。

b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。

⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

⑧仪器：PCR扩增仪。

(3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。

【强化记忆】图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？提示第3轮。

(2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。

提示第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。

主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以 是一些具有调控作用的因子。
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌 抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰 岛素基因等。
（一）获取目的基因的常用方法有哪些?
初始目的基因的来源 1. 从生物中直接获取 2. 人工合成
注意：要保持基因的完整性
目的基因的核苷酸序列未知）含有某种生物不同基因的许多DNA片断， 导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有 这种生物的不同基因，称为基因。基因基因组
部分基因 （如:cDNA）•9、要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲共学；要学生守的规则，教职员躬亲共守。2021/8/122021/8/12Thursday, August 12, 2021 •10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。2021/8/122021/8/122021/8/128/12/2021 9:54:53 PM •11、只有让学生不把全部时间都用在学习上，而留下许多自由支配的时间，他才能顺利地学习……（这）是教育过程的逻辑。2021/8/122021/8/122021/8/12Aug-2112-Aug-21 •12、要记住，你不仅是教课的教师，也是学生的教育者，生活的导师和道德的引路人。2021/8/122021/8/122021/8/12Thursday, August 12, 2021
PCR技术扩增与DNA复制的比较
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下 变性解旋
体外复制
解旋酶催化 细胞核内
热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段 形成整个DNA分子
3.人工合成
——根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列

b.用农杆菌感染时，优先选择 受伤的
（受伤的/完好的）叶
片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由
是
叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类。物质，可吸引农杆菌
三.基因工程的基本操作程序 3DNA三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取 ②基因的种类: 基因组和部分基。因
基因组DNA与cDNA的比较类型 大小基因中启动子（具有启动作用 的DNA片段） 基因中内含子(位于编码蛋白质 序列的非编码DNA片段）
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
（1）构建目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定；存在,并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作。用
（2）构建过程：
同种限制酶
如果使用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，有何优点?
。
可防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与运载体的反向连接
若只考虑两两连接，质粒和目的基因至少可以连接 3 种；
【思考】合成引物时是否需要知道目的基因的所有的碱基序列？
三.基因工程的基本操作程序 1.目的基因的获取
(3)利用PCR技术扩增目的基因 ⑥两种引物的要求：
引物自身不能环化 两种引物之间不能互补配对 引物长度不宜过短，防止。引物随机结合
三.基因工程的基本操作程序 例.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标 注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
③终止子：使 转录 终止的特殊结构的DNA片段。
④标记基因：四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基
种类：
因等抗生素抗性基因 。
作用： 用于鉴别和筛选含有目的基。因的受体细胞
⑤复制原点： DNA分子复制的。起点

基因工程的基本操作程序基因工程是一项综合性的技术，它涉及到从一个生物体中获得DNA序列的特定片段，然后通过各种技术方法将这些片段插入到另一个生物体中。

基因工程的基本操作程序包括以下步骤：1.DNA提取：首先需要从源生物体中提取目标DNA片段。

这通常涉及到细胞破碎、核酸提取和纯化等步骤。

现代基因工程技术还可以利用聚合酶链式反应（PCR）直接扩增特定的DNA片段。

2.DNA切割：接下来，需要将目标DNA片段切割成更小的片段。

这可以通过使用限制酶来实现，限制酶能够识别特定的DNA序列，并在这些序列上切割DNA。

切割后的DNA片段具有粘性末端，即其中一末端具有未配对的碱基。

3.DNA连接：将需要连接的DNA片段混合在一起，并通过DNA连接酶的作用将它们连接起来。

DNA连接酶可以识别并连接具有互补碱基的末端，从而形成连续的DNA分子。

这个过程也可以通过使用DNA连接酶以外的方法，如化学连接或缩合酶连接等。

4.DNA插入：将连接好的DNA片段插入到目标生物体中。

这可以通过多种技术手段来实现，例如：转化（将DNA通过物理或化学方法导入到细胞中）、转染（通过封装在载体中的DNA转导到细胞中）和病毒载体等。

5.基因表达：一旦DNA片段被成功插入到目标生物体中，就可以进行基因表达。

这通常涉及到通过细胞的生物学过程，如转录和翻译，在转录时生成RNA分子，并通过翻译将其转化成蛋白质。

6.分析和鉴定：最后，需要对基因工程产品进行验证和鉴定。

这可以通过多种技术方法来实现，如聚合酶链式反应（PCR）、DNA测序、基因组学和蛋白质分析等。

需要注意的是，基因工程的具体操作步骤可能因应用领域和技术要求而有所不同。

此外，基因工程涉及到复杂的技术和伦理问题，因此需要专业人士具备严格的实验操作和伦理意识。