层_层自组装构建固相可降解基因传递体系的研究_任科峰
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[研究快报]层-层自组装构建固相可降解基因传递体系的研究任科峰,计 剑,沈家骢(浙江大学高分子科学与工程学系,杭州310027)
关键词 生物降解;聚赖氨酸;基因传递;层-层自组装中图分类号 O631.3 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2004)08-1576-03
收稿日期:2004-03-03.基金项目:国家自然科学基金(批准号:50373036)资助.联系人简介:计 剑(1969年出生),男,博士,副教授,主要从事生物医用高分子、血液相容性材料、介入医用材料和组织工程材料的研究.E-mail:jianji@mail.hz.zj.cn
近年来,随着人类对基因研究的深入,基因治疗作为一种新的手段,受到人们的广泛重视.在组织工程材料、介入医用材料和医用植入体的应用中,与传统的溶液给药方式不同,基因技术需要一种可直接作用于材料表面贴壁细胞的长效、高转染固相基因传递体系.目前,国内外研究者将蛋白质药物缓释系统应用到基因传递体系中,将DNA分子和聚乳酸、胶原等可降解聚合物混合,制备了聚合物基因涂层支架,获得在周围细胞环境中的长效、高浓度DNA,但由于DNA在涂层中的储存稳定性差,裸DNA不能有效穿透细胞屏障,无法获得高基因转染率[1].因此,开发新的方法构建含有基因的超薄膜,实现基因分子的精确控制释放具有十分重要的意义. 自从Decher等[2]提出由带相反电荷的聚电解质在液-固界面通过静电作用交替沉积形成多层膜的
Fig.1 ConstructionofbiodegradablethinmultilayerfilmsviaLbLdepositionofPLLandDNA(A)anddegradationoffilmsbyenzymes(B)
技术以来,层-层自组装方法被认为是一种构筑复合有机超薄膜结构的有效方法,展现出广泛的应用前景[3,4].该方法制备条件温和,有序的组装体可保护生物大分子的二级结构和生物稳定性,并可在复杂体型结构的装置上实现.这些独特的优点都为其在材料表面构建生物分子的精确控释体系提供了良好的条件[5].本文拟利用聚赖氨酸(PLL)的正电性和脱氧核糖核酸(DNA)的负电性,通过分子层-层自组装方法,构建可降解聚电解质和DNA的多层超薄膜(图1),并进一步研究该多层超薄膜的酶解释放行为,为建立长效、高转染率的固相基因传递体系提供依据.1 实验部分1.1 试剂 聚赖氨酸(PLL,Mw=80000)购自Sigma公司;脱氧核糖核酸(鱼精DNA,钠盐,高纯级)和羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs,高纯级)购自Amresco公司;胰凝乳蛋白酶(T-Chymotrypsin,74U/mg蛋白质)购自Worthington公司;实验用水均为三次蒸馏水.其余试剂均为分析纯.1.2 多层超薄膜的组装及表征 将石英玻璃片(10mm×20mm)浸入H2O/H2O2/浓氨水(体积比为5∶1∶1)的溶液中,于60℃煮20min,取出后用水反复清洗,用氮气吹干.将石英片浸入PLL溶液(2mg/mL,HEPEsbufferpH=7.4,75mmol/LNaCl)中30min,取出,在三蒸水中浸洗5次,用氮气吹干;然后浸入DNA溶液(1mg/mL,HEPEsbufferpH=7.4,75mmol/LNaCl)中30min,取出,在水中浸洗5次,用氮气吹干.重复上述过程,得到不同层数的多层超薄膜.所有样品均在真空干燥器中
Vol.25高等学校化学学报 No.8
2004年8月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 1576～1578
室温干燥过夜,用紫外-可见光谱仪(CARY100BIO,America)测定其紫外吸收曲线.1.3 多层超薄膜的降解及表征 用(PLL/DNA)10超薄膜作为降解样品,浸入磷酸缓冲液(PBS,pH=
Fig.2 ThetypicalAFMimageofthescratchon10bilayersfilms
7.4,37℃)中,溶液中含有5U/mL的胰凝乳蛋白酶(一种胰腺消化酶,普遍用于蛋白质或多肽的降解实验[6]).降解一定时间后,取出,用三蒸水清洗,于真空干燥器中干燥过夜.用原子力显微镜(AFM,SPA400,SEIKO)的针尖在接触模式下对样品表面进行反复刮擦(250nN,4min),然后在原位用轻敲模式扫描,得到膜表面与石英基底的距离,即超薄膜的厚度(图2).对降解不同时间的超薄膜,测定其厚度和紫外-可见光吸收强度的变化.2 结果与讨论2.1 超薄膜的组装 DNA/PLL可降解聚电解质多层超薄膜通过PLL和DNA的交替组装制备.聚赖
Fig.3 UV-VisabsorptionspectraofPLL/DNAfilmsasafunctionoflayernumbershowingincreasingDNAwithinthefilmsTheinsetshowsaplotofDNAabsorptionat260nmasafunctionofbilayernumber.TheoutmostlayerwasDNAlayer.
氨酸是常用的聚阳离子,而DNA具有较强的负电性,因此两者可以通过静电吸附组装成超薄膜.接触角测定结果表明,超薄膜在组装过程中呈现对应于PLL和DNA的亲疏水交替变化.图3是不同层数的层-层自组装超薄膜的紫外吸收图.聚赖氨酸在200～350nm处没有紫外吸收,260nm处是典型的DNA吸收峰.图3插图显示超薄膜中DNA吸收强度随自组装层数的增加呈线性增加.说明聚赖氨酸和DNA可以成功地自组装成多层超薄膜.2.2 超薄膜降解中DNA的释放 在本研究体系中,聚赖氨酸起到了两个作用:(1)作为聚阳离子进行层-层自组装;(2)作为可生物降解材料,控制DNA的释放.DNA也起到了两个作用:(1)作为聚阴离子进行层层自组装;(2)作为功能性材料被释放.
Fig.4 RelativeUV-Visabsorptionspectraofdegradablefilmsat260nmasafunctionofdegradationtimeinPBSwithoutenzyme(a)andwith5U/mLα-Chymotrypsin(b)Thevaluesaregivenasmean±standarddeviation(n=3).
Fig.5 Film’sthicknessdecreasedasafunctionofdegradationtimeforPLL/DNAfilmsThevaluesaregivenasmean±standarddeviation(n=5).
用胰凝乳蛋白酶模拟DNA/PLL可降解聚电解质多层超薄膜的生物酶解行为.聚赖氨酸由多肽键构成,可被胰凝乳蛋白酶催化降解;而胰凝乳蛋白酶对DNA不具有降解活性.图4结果表明,DNA/
1577No.8任科峰等:层-层自组装构建固相可降解基因传递体系的研究 PLL可降解聚电解质多层超薄膜呈平缓的逐步释放过程,随着降解时间的延长,DNA吸收强度呈现近似线性的下降,在释放90%的DNA过程中均未出现显著的突释现象.用AFM观察降解表面的形貌,发现在降解过程中膜表面粗燥度增加,但未发现大块的膜剥落现象.随着降解时间的增加,膜的厚度呈线性逐步下降,35h后,约85%的膜被降解(图5).在已有的一些研究中[7～9],常常是超薄膜的整体崩解,这对膜中的功能性物质的控释不利.本文结果表明,PLL/DNA超薄膜在酶存在的生理环境下的降解是一种表面逐步降解,而非崩溃型降解,这对DNA的控制释放具有重要的意义.3 结 论 利用聚赖氨酸和DNA通过层-层自组装的方法构建了一种可生物降解的超薄膜.紫外光谱表明,聚赖氨酸和DNA的组装得到了规整均一的超薄膜.这种超薄膜可生物降解,并近似线性地释放DNA,其降解行为是表面逐步降解,而非崩溃型降解.
参 考 文 献[1] KlugherzB.D.,LevryR.J.,JonesP.L.etal..NatureBiotechnology[J],2000,18:1181—1184[2] DecherG.,HongJ.D..BerBunsen-Ges.Phys.Chem.[J],1991,95:1430—1433[3] WUTao(吴 涛),ZHANGXi(张 希).Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)[J],2001,22(6):1057—1065[4] CAOTing-Bing(曹廷炳),YANGShu-Ming(杨术明),ZHANGMao-Feng(张茂峰)etal..Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)[J],2002,23(6):1213—1215[5] SaldittaT.,SchubertbU.S..ReviewsinMolecularBiotechnology[J]2002,90:55—70[6] MingzhongLia,MasayoOgisob,NorihikoMinourab.Biomaterials[J],2003,24:357—365[7] SukhishviliS.A.,GranickS..Macromolecules[J],2002,35:301—310[8] SchǜlerC.,CarusoF..Biomacromolecules[J],2001,2:921—926[9] DubasS.T.,SchlenoffJ.B..Macromolecules[J],2001,34:3736—3740
ConstructionofBiodegradableMultilayerFilmsviaLayer-by-layerSelf-assemblyasGeneDeliverySystem
RENKe-Feng,JIJian*,SHENJia-Cong(DepartmentofPolymerScienceandEngineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)
Abstract Biodegradablemultilayerfilmsofalternatingpoly-L-lysine(PLL)anddeoxyribonucleicacid(DNA)layerswerefabricatedontoquartzsubstratesbythelayer-by-layer(LbL)self-assemblymethod.UV-VisiblespectrashowedthatPLLandDNAcansuccessfullybeadsorbedandformmultilayerfilmsviaLbL.Degradationexperimentswerecarriedoutwithenzymes.AFMwasutilizedtomeasurethechangesofthicknessofmultilayerfilms.Thegradualdecreaseofthicknessofmultilayerfilmswiththeincreaseofdegradationtimewasobserved.Inourexperiments,about85%offilmswasdegradedin35h.OurstudyprovidedanovelgenedeliverysystemusingLbLmethod,whichmaybeappliedtogenetherapy.Keywords Biodegradation;Poly-L-lysine;GeneDelivery;Layer-by-layerself-assembly(Ed.:W,Z)
