基因组学基因组测序和序列组装64页PPT

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第四代测序技术——纳米孔测序技术
原理：分子在通过纳米孔道时，会对通过纳米孔的电流，或横 穿过纳米孔的电流（隧穿电流）产生影响，而每种不同的分子 通过时，对电流产生的影响具有可区别的差异。于是利用这种 差异，纳米孔测序技术就可以识别基因中碱基（对）的排列顺 序。
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1号染色体——生命。讲生命的诞生，来源。 2号染色体——物种。人类发展和近亲之间的分别。
人
3号染色体——历史。孟德尔以及其他科学家在遗传学上做出的贡献。 4号染色体——命运。你的命运完全在你的基因里。
种
5号染色体——环境。推翻让读者觉得基因是简单的分割开来的。
自
6号染色体——智慧。基因的存在不是为了致病的 7号染色体——本能。解释行为遗传学和进化心理学结论对人类的影响。
对的碱基在原样品DNA分子上
的位置。此后各组反应物通过聚
丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通
过放射自显影检测末端标记的分
子，并直接读取待测DNA片段
的核苷酸序列。
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第二代测序技术
特点：
大大降低了测序成本的同时，
大幅提高了测序速度，
持了高准确性，
序列读长方面起第一代ppt课测件. 序技术则要短很多。
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人类基因组计划——概述
人类基因组计划(human genome project, HGP)： 是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美 国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预 算达30亿美元的人类基因组计划。 意义： •人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大 科学计划。 •被誉为生命科学的“登月计划”。 中国： 中国于1999年9月积极参加到这项研究计划中的，承担其中1% 的任务，即人类3号染色体短臂上约3000万个碱基对的测序任 务。中国因此成为参加这项研究计划的唯一的发展中国家。

• 重要区域的优先测序
– 人类疾病相关基因，功能相关的基因常常聚集 在染色体的特定区域，优先选择基因富集区测 序。
–人类主要组织相容性复合区（human major histocompatibility complex, hMHC ），与 人类免疫系统有关，6号染色体，3.6Mb，平均 每16kb 1个基因，多态性最丰富的区域，有些 座位等位基因成员超过200个
• 基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完 整的DNA顺序。最佳状况是将物理图谱和遗传图谱 进行有机整合，以确定基因以及其他重要的序列 在DNA顺序中的位置。
• 主要内容： • 1.DNA测序的方法 • 2.DNA序列的组装 • 3.基因组测序的其他路线 • 4.人类基因组的测序和组装
测
• DNA测序技术主要有两种方法，都是在20 世纪70年代中期发明的。
• 首先在整个水稻基因组上生成许多已知长度的DNA切片， 然后使它们按DNA序列的重合区域进行排列。这些切片数 量足以覆盖水稻基因组４次。接着，确定每个切片的碱基 对序列，并用计算机程序将其组装成更长的片段，然后将 这些片段排序、装配成１０万多个被称为支架的更大组件。
• 设计出的软件重点是通过支架水平上的接近来进行组装， 并采取了独特的重复序列处理算法，可识别并暂时屏蔽占 水稻基因组约40％的重复序列。这样做的好处是既能减少 计算量，又最大限度降低了错误拼接的可能性。
• 根据克隆插入子两端的DNA序列查找与之连接的克 隆建立重叠群，直到覆盖整个DNA片段，甚至染色 体
• 拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群，先进 行各个BAC克隆的随机测序，再进行序列组装
• 引导鸟枪法
–构建插入片段为2kb的人类基因组质粒， 每个克隆经双向测序可读500bp

基因组测序基本原理
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar genome)
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序技术是新一代 DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无 须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准确地确定DNA 序列。
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序，一则自身测序费用比较高，而且荧光试剂容 易粹灭，同时也比较消耗时间，另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成:

感谢您的观看
THANKS
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基因组序列组装
序列组装的基本流程
序列读取
通过测序技术获取基 因组序列的原始数据。
序列质量评估
对原始数据进行质量 评估，去除低质量序 列和错误序列。
序列比对
将高质量序列比对到 参考基因组或组装到 独立的基因组上。
序列拼接
将比对或独立基因组 上的序列片段拼接成 完整的基因组。
组装后验证
对组装得到的基因组 进行验证，确保其完 整性、准确性和一致 性。
下一代测序技术
总结词
更高通量、更低成本、更短周期的测序技术。
详细描述
下一代测序技术是一种尚未完全成熟的测序技术，目 前正处于研究和发展阶段。相比于前几代测序技术， 下一代测序技术将具有更高的通量、更低的成本和更 短的周期等特点。它可能采用更加先进的纳米技术、 光学技术和生物信息学技术等手段，以提高测序的准 确性和速度。下一代测序技术的出现将为基因组学和 生物医学领域的研究提供更加高效装得到的基因组的完整性，包括染色 体水平的完整性和基因水平的完整性。
准确性评估
评估组装得到的基因组的准确性，包括单核苷酸水 平上的准确性和结构变异上的准确性。
一致性评估
评估组装得到的基因组的一致性，包括不同 组装方法或不同数据集之间的一致性和内部 的一致性。
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基因组测序与序列组装的挑 战与前景
例如，通过研究水稻基因组，科学家们发现了与抗旱、耐盐等抗逆性状相关的基因，为培育抗逆性更强的水稻品种提供了重 要的理论依据。
病原微生物基因组研究
病原微生物基因组研究是利用基因组测序和序列组装技术来了解病原微生物的基因组结构和功能，旨 在发现新的药物靶点、疫苗候选基因和诊断标记物等。

“双脱氧末端终止”的含义
Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
自动化测序
荧光染料标记物的发明： 使链终止法用于自动化测序，用不同的荧光 色彩标记ddNTP，如ddATP标记红色荧光， ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光， ddTTP标记绿色荧光。由于每种ddNTP带有 各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同 时判读4种碱基。
（四）影响测序的因素 不管采用随机测序还是定向测序都可碰到下列影响因素。 1.计算机的设备 。 2.靶DNA的性质。 3.完成测序所需的时间 。 4.采用测序策略。
三．微生物基因组的注释 （一）概念：在微生物基因测序的基础上，对其基本结 构和部件进行认定，以进一步研究其功能。
（二）微生物基因组注释的内容 1.碱基组成分析，即G+C Mol%测定。 G+C含量是物种的一个重要特征，在微生物的分类上具有重要意义，是重 要参数之一。 2．开放阅读框的鉴定： 3．编码序列分析
向测序法包括引物测序法和定向缺失测序法。 ⑴引物测序法 即在第一次测序结果的基础上，设计新的寡核苷酸，来充当下一次测
序反应的引物，并依次类推，从而循序渐进获得靶DNA的全部序列。
⑵定向缺失法 定向缺失法是将一个靶DNA变成若干套嵌套的缺失突变体，使靶序列中远
不可测的区段逐渐落入可用通用引物进行测序的方法。
黏粒载体（ cosmid ）
P1人工染色体载体（PAC）
目前常用的人造染色体载体
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YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒1 EcoRI CEN4
酵母染色体的着丝粒序列 Apr
pYAC
URA3
4
酵母系统的选择标记
ori
大肠杆菌的复制子标记

几乎所有基因〔或操纵子〕上游都有调控序列， 它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。
通过同源性比较来预测mRNA的5’端，最常用的 与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库 (The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. epd.unil.ch/ )。
G 外显子－内含子边界
外显子和内含子的边界有一些 明显的特征，
如:内含子的5‘端或称供体位 〔donor site〕常见的顺序为 5’－ AG↓GTTAAGT-3’；
3’端又称受体位〔acceptor site), 多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG3’(“Py〞嘧啶核苷酸，T或C)；
H 上游控制顺序
第二讲 基因组序列诠释
问题
基因组序列所包含的全部遗传信息是什 么？
基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因，研究基因地功能
呢？
1. 寻找基因
1.1 根据开放读码框预测基因 A 起始密码子 ATG 第一个ATG的确定(依据Kozak规则);
Kozak规则是基于已知数据的统 计结果.
同源有如下几种情况：
A DNA序列某些片段完全相同； B 开放读码框〔ORF〕排列类似，如有长
外显子； C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性； D 模拟多肽高级结构相似
1.3 试验分析
Northern 杂交确定DNA片段是表达 序列.
本卷须知： a 当某一基因的转录产物进行可变 剪接时，由于连接的外显子不同， 会产生好几条长度不一的杂交带;
反义表达载体
Nc o I Bst EII
35S pro
HbR
300bp p3301-HbR(11030bp)

英国：Sanger Center 日本：RIKEN 中国：华大基因研究中心（北京、杭州）
国家人类基因组中心（北京、上海）
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பைடு நூலகம்
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大规模基因组测序的几个支撑技术
❖ Sanger双脱氧末端终止法 ❖ PCR 技术 ❖ DNA 自动测序仪的发展 ❖ 生物信息学分析软硬件设施
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“双脱氧末端终止”的含 义
• 计算生物学和系统生物学研究的未来 (>1050)
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世界大型基因组研p究pt课件.中心
美国：1) National Human Genome Research Institution in NIH 2) Genome Center at White Head/MIT 3) Washington University Genome Center 4) Joint Genome Institution at DOE 5) Genome Center at Baylor Medical Collage
• 基因组的信息是用来发现和解释具有普遍意义的生命现
象和它们的变化、内在规律和相互关系。
• 基因组的信息含量高。基因组学的研究又在于基因组间
的比较。
• 基因组学的复杂性必然导致多学科的引进和介入（各生
物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、物理 学、电子工程学、考古学等）。
• 基因组学研究的手段和技术已经走在生命科学研究的最
前沿。
• 基因组信息来自于高效率和规模化所产生的实验数据。 • 人类基因组计划证明了基因组研究的迫切性和可行性。
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基因组与生命之谜
• 基因组的产生与进化。 • 基因组DNA组分的变化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。 • 遗传密码的发生、发展和进化。 • 内含子（尤其是大于100，000 核苷酸的大内含子）剪

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组装结果的评价标准
N50 大小： 把组装出的contigs 或 scaffolds从大到小排列，当其累计长度刚刚超过 全部组装序列总长度一半时，最后一个contig或scaffold的大小。 单碱基错误率： 与参考序列比较后发现的小尺度上的不同所占的比例。所谓小尺 度，在这里通常指小于标准测序长度，即500bp。实际上常常只是几个碱基。 错误组装的Contig： 测序数据组装中出现的错误。由定义，它涉及的片段一般大 于500-bp。包括与参考序列相比，插入、删除，以及在方向和次序上不同的片段。 错误组装的Scaffold：把非重叠contig连接在一起时出现的错误。包括嵌套，错误 的方向和顺序等。
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RePS 的流程 图
第145页/共56页
scaf f ol d const r uct
super - scaf f ol d const r uct
RePS2的新流程图
j oi n mo r e
cont i gs
wi t h
t han
t wo
A
j oi n mo r e
cont i gs
MDR
(42.2%)
BDR’
(~25%)
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BDR
(~50%?)
重复序列的检测与处理
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插入片段大小引起的错误组装
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Target region [Mb]
Masked sequence
# of contigs by LW
Human Human
cont i gs
cont i g
A : p l a s mi d