对拟南芥转录因子

拟南芥 WRKY 基因家族应答非生物胁迫基因的鉴定1）

魏晓爱;姚文静;姜廷波;周博如

【摘 要】WRKY转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族，在植物生长发育和应答各种胁迫反应过程中起重要作用。为筛选和鉴定植物抗逆关键基因，以拟南芥（ Arabidopsis thaliana） WRKY家族基因为研究对象，从数据库中搜索到72个拟南芥WRKY基因，通过生物信息学分析，根据其结构特点，可将其分为3大类：GroupI、GroupII和GroupIII。其中，GroupII又可分为5个亚类：IIa、IIb、IIc、IId和IIe。用实时定量RT－PCR筛选出30个应答盐胁迫的基因，其中上调表达的23个，下调表达的7个。%For screening and identifying stress-related genes in Arabidopis s thaliana, the WRKY gene families were as

study ob-ject, and 72 WRKY genes were explored from the database of

A.thaliana, and the structure characteristics were analyzed by

bioinformatics.WRKY family was further divided into three groups:GroupI,

GroupII and GroupIII.The gene members in GroupII were further divided

into five sub-groups: IIa, IIb, IIc, IId, IIe.The differential expression of WRKY

genes were determined by real-time RT-PCR.There were 30 genes

李　鹏．利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统编辑拟南芥ＩＬＲ３基因及功能验证［Ｊ］．江苏农业科学，２０２０，４８（１４）：７８－８２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２０．１４．０１２利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统编辑拟南芥ＩＬＲ３基因及功能验证李　鹏（上海辰山植物园／中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海２０１６０２） 摘要：拟南芥转录因子ＩＬＲ３（ＩＡＡ－ＬｅｕｃｉｎｅＲｅｓｉｓｔａｎｔ３）在铁稳态的调节、葡萄糖异硫氰酸盐（ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ，简称ＧＬＳ）的生物合成和病原体响应方面起到重要作用。为更深入探索该转录因子在植物体内的更多功能，利用ＹＡＯ基因启动子驱动Ｃａｓ９在拟南芥中表达，成功获得ＩＬＲ３基因编辑突变体。测序结果及序列分析结果表明，在ＩＬＲ３编辑拟南芥中，该基因编码区发生了碱基缺失或插入，导致蛋白ＩＬＲ３保守结构域丢失。并且，这些基因编辑突变体Ｔ２代幼苗与Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ｉｌｒ３－２在缺铁环境下表现出相同的性状，进一步验证ＩＬＲ３转录因子在植物对铁的吸收及体内平衡的作用，也为深入研究其更多生物学功能奠定了工作基础。 关键词：拟南芥；ＡｔＩＬＲ３；ＹＡＯ启动子；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；基因编辑 中图分类号：Ｑ７８４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２０）１４－００７８－０５

收稿日期：２０１９－０８－０１基金项目：上海市青年科技英才扬帆计划（编号：１９ＹＦ１４１４８００）。作者简介：李　鹏（１９８３—），男，安徽濉溪人，硕士，工程师，主要从事植物抗逆性研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｎｇｌｅｅ９８＠１６３．ｃｏｍ。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ９）系统已被用于基因组编辑，具有很高的准确性，并能高效完成真核基因组中基因敲除（ｋｎｏｃｋｏｕｔ／ｋｎｏｃｋｉｎ）和点突变［１］，在人类细胞［２－３］、植物［４］、动物［５］、微生物［６］中均得到了很好的应用，并取得了举世瞩目的成果。ＹＡＯ参与拟南芥的胚胎发生及配子发育，主要表达于分裂能力强的组织中［７］；中科院遗传与发育生物学研究所谢旗研究组通过ＹＡＯ基因启动子驱动Ｃａｓ９，极大地提高ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９编辑拟南芥基因组的效率［８］。ＡｔｂＨＬＨ１０５／ＡｔＩＬＲ３（ＩＡＡ－ＬｅｕｃｉｎｅＲｅｓｉｓｔａｎｔ３）基因属于拟南芥ｂＨＬＨ家族Ⅳｃ亚家族［９］，所编码的蛋白可与其他诸多蛋白协同作用，共同参与植物铁稳态的调节［１０－１１］。笔者所在课题组在长期的研究中发现，ＩＬＲ３在植物生长发育过程中发挥更多的生物学功能。因此，本研究首次利用ＹＡＯ基因启动子驱动的Ｃａｓ９编辑拟南芥ＩＬＲ３基因，所获得的基因编辑株系发生碱基插入和缺失，与Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ｉｌｒ３－２在缺铁处理时具有相同的表型，与文献报道结果一致，为研究ＩＬＲ３在生物体中的更多功能，奠定工作基础。１　材料与方法１．１　材料本试验所用拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）野生型为Ｃｏｌ－０，突变体ｉｌｒ３－２（Ｓａｌｋ＿００４９９７Ｃ）购买自网站ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／，双元表达载体ｐＹＡＯ－Ｃａｓ９－ＳＫ由中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究组馈赠，大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α和根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５由笔者所在实验室保存。限制性内切酶ＢａｍＨⅠ购自ＮＥＢ（北京）公司，质粒提取和胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Ｔ载体、ＤＮＡ连接试剂盒、ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司，其他生化试剂及引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。１．２　拟南芥ＡｔＩＬＲ３编辑靶位点的确定将拟南芥ＡｔＩＬＲ３基因（Ａｔ５ｇ５４６８０）提交ＮＣＢＩ检索，获得其基因序列及外显子序列信息，在外显子区域寻找ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）位点为“ＮＧＧ”的２３ｂｐ序列，且该序列最好带有酶切位点，并通过拟南芥ｂＨＬＨ家族各成员同源序列比对验证该靶位点的特异性。针对筛选到的靶位点，在序列５′端添加ＢｓａⅠ限制性内切酶的黏性末端接头ＴＧＡＴＴ和ＡＡＡＣ，分别设计引物Ｐ１－Ｆ和Ｐ１－Ｒ（表１）。 表１　引物名称及序列引物名称序列（５′→３′）Ｐ１－ＦＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＰ１－ＲＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＰ２－ＦＴＧＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＣＧＧＧＡＡＴＴＧＰ２－ＲＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＴＧＣＨｙｇＲ－ＦＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＡＧＴＧＨｙｇＲ－ＲＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＬＰＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＲＰＴＧＣＴＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＬｂＢ１．３ＧＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣ１．３　ｇＲＮＡ的合成及与载体的连接将１０μｍｏｌ／Ｌ的Ｐ１－Ｆ和Ｐ１－Ｒ各取１μＬ，加入到８μＬ退火缓冲液（ＴＥ＋５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）中，混匀后在ＰＣＲ仪中退火：从９５℃缓慢降温至１６℃，速率为０．１℃／ｓ；取１μＬ退火产物，与用ＢｓａⅠ酶切过的载体ｐＹＡＯ－Ｃａｓ９－ＳＫ进行连接，体系如下：１μＬ退火产物，１μＬ载体，１μＬ１０×Ｔ４缓冲液，０．５μＬＴ４连接酶，加ｄｄＨ２Ｏ至１０μＬ，连接条件为２５℃反应２ｈ。采用热激法转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，经筛选鉴定后测序。将测序正确质粒导入农杆菌感受态ＥＨＡ１０５。１．４　拟南芥遗传转化及基因编辑植株的获得采用浸花法对拟南芥进行转化［１２］，收集转化后的Ｔ０代种子，干燥后，７５％乙醇消毒１ｍｉｎ，１０％次氯酸钠消毒１０ｍｉｎ，无菌水漂洗５次，均与播种于含潮霉素２５ｍｇ／Ｌ的１／２ＭＳ表面进行抗性筛选，培养条件为２２℃，１６ｈ光照，８ｈ黑暗。２周后，选取有潮霉素抗性的拟南芥幼苗，移栽至土壤基质中生长，同时摘取１张叶片，采用改良的ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ，并以此ＤＮＡ为模板，以潮霉素抗性基因序列设计引物ＨｙｇＲ－Ｆ、ＨｙｇＲ－Ｒ（表１），进行ＰＣＲ鉴定。ＰＣＲ体系：在２０μＬ反应体系中，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ，ｄＮＴＰ各０．２５μｍｏｌ／Ｌ，引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，１００ｎｇ模板ＤＮＡ。ＰＣＲ反应程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，循环３０次；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。１％琼脂糖凝胶电泳后检测，能完整扩增出潮霉素抗性基因的个体为转基因拟南芥阳性植株。Ｔ１、Ｔ２代拟南芥阳性植株采用相同方法鉴定。根据基因ＡｔＩＬＲ３序列，在靶位点上下游２００～３００ｂｐ处设计引物Ｐ２－Ｆ、Ｐ２－Ｒ（表１、图１），以Ｔ２代转基因拟南芥阳性植株的基因组ＤＮＡ为模板，再次进行ＰＣＲ，反应体系与程序与上述相同，扩增产物为含靶位点的５６２ｂｐ的片段。电泳后，回收目的片段，取其中一部分进行限制性内切酶处理。将未被切开的ＰＣＲ片段克隆到Ｔ载体，转化至大肠杆菌中，并对插入片段进行菌落ＰＣＲ，阳性克隆进行质粒提取并测序。１．５　ＡｔＩＬＲ３编辑拟南芥的表型分析将拟南芥野生型、ｉｌｒ３－２突变体及获得的４个株系的ＩＬＲ３编辑拟南芥Ｔ１代幼苗，播种于１／２ＭＳ、１／２ＭＳ－Ｆｅ和１／２ＭＳ－Ｆｅ＋５０μｍｏｌ／Ｌ菲洛嗪（ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ，Ｆｒｚ）培养基，２周后，拍照并统计最长根长度。采用三引物法［１３］对ｉｌｒ３－２突变体进行鉴定，引物ＬＰ、ＲＰ和ＬｂＢ１．３位点及序列见图１和表１。２　结果与分析２．１　ＡｔＩＬＲ３编辑靶位点的筛选及载体构建序列分析结果表明，ＡｔＩＬＲ３基因包５个外显子，４个内含子，编码区全长７０５ｂｐ，根据ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９设计原理，选择其第２个外显子上的特异序列为编辑靶序列（图１），并且该靶位点ＰＡＭ序列前６ｂｐ包含１个ＢａｍＨⅠ限制性内切酶位点（ＧＧＡＴＣＣ），方便检测。根据靶位点序列合成靶点接头引物Ｐ１－Ｆ和Ｐ１－Ｒ，退火形成靶点接头后克隆到ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体ｐＹＡＯ－Ｃａｓ９－ＳＫ［８］，测序后将正确质粒导入农杆菌感受态ＥＨＡ１０５。２．２　拟南芥基因编辑植株的获得及鉴定利用引物ＨｙｇＲ－Ｆ、ＨｙｇＲ－Ｒ做ＰＣＲ鉴定得到转基因阳性苗；利用Ｐ２－Ｆ、Ｐ２－Ｒ为引物，阳性苗基因组ＤＮＡ为模板，扩增出含靶位点的ＤＮＡ片段；回收此片段，用ＢａｍＨⅠ酶切鉴定电泳后，获得４株ＩＬＲ３基因编辑拟南芥幼苗。如图２－Ａ所示，野生型的片段被ＢａｍＨⅠ识别，并完全切断为２个长度分别为２７６、２８６ｂｐ的片段（由于２个片段大小过于接近，电泳结果只看到１条带），而突变片段的扩增产物则无法被识别和切割。将未消化的ＰＣＲ片段克隆到Ｔ载体中，转化大肠杆菌，并将插入片段进行菌落ＰＣＲ，阳性单菌落培养过夜后提取质粒进行测序。结果表明，在靶点位置发生不同类型的编辑，在ＰＡＭ序列前３～７ｂｐ分别产生了插入和缺失突变，其中缺失突变占多数

拟南芥成花途径

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拟南芥成花途径

摘 要

成花转变是一个复杂的过程，不仅是形态上的变化，而且包括在花芽分化前发生的一系列复杂的生理生化变化，通过感受外部环境因子〔包括光周期、温度和GA等〕变化，经内源因子〔包括营养状况和年龄发育阶段等〕作用，最终促进茎尖分生组织分化形成花或花序，保证生殖最优化。成花过程是一个复杂的调控网络，拟南芥中至少有7条成花调控途径，其中包括了一些编码不同类型蛋白的“成花整合因子”，它们通过整合各个途径的信号调控成花时间，例如能够快速促进花发育的FLOWERING LOCUS T (FT)和SUPPRESSOR OF

OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1)。

关键词：光周期途径；春化途径；自主途径；年龄途径；赤霉素途径；常温途径；糖类途径

拟南芥成花途径

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目前拟南芥中至少有7条主要的信号途径参与调控，即响应日照长度和感应光质调控开花的光周期途径〔photoperiod pathway〕，低温促进成花的春化途径〔vernalization pathway〕，赤霉素调控植物成花的赤霉素途径〔GA pathway〕，与赤霉素和光周期不相关而依赖自身发育状况的自主途径〔autonomous pathway〕，响应温度的常温途径〔ambient temperature pathway〕，通过增加植物的年龄调控成花的年龄途径〔age pathway〕以及通过植物体内碳水化合物代谢状态调控成花的糖类途径〔Trehalose-6-Phosphate pathway〕。

图 1-1. 拟南芥开花途径概览〔Fabio et al.,2013;Khan et al.,2013〕

Figure 1-1. Overview of flowering pathways in Arabidopsis〔Fabio et al.,2013;Khan et al.,2013〕

拟南芥开花过程的转录后调控研究进展

杨秀娟;梁婉琪

【摘 要】从营养生长向生殖生长的转换是植物生命周期中最重要的事件之一,是植物繁衍后代的重要保证.为适应复杂的环境条件和自身的发育需求,开花基因在转录激活/抑制、转录后、翻译及翻译后等多个水平上被调控,其中染色质重构、组蛋白修饰等表观遗传调节是拟南芥春化途径和自主途径的主要调节方式.最近的研究结果表明,选择性剪接、小RNA和长非编码RNA等多种转录后水平方式的调节在拟南芥开花基因调节中发挥重要作用.本文就目前有关拟南芥开花基因转录后调控方式研究进展进行综述,以期为今后进一步完善开花时间调控网络提供参考.%Transition from vegetative to reproductive phase is a major event

during the life cycle of plants which is essential for reproduction. Adapt to

the complex environmental and endogenous cues, the plants have evolved

multiple regulatory layers, including transcriptional, post-transcriptional,

translational and post-translational ones to control the function of

flowering controllers. And it has been demonstrated that epigenetic

regulation such as chromatin remodeling and histone modification are

main regulation patterns in vernalization pathway and autonomous