拟南芥B3转录因子基因超家族_罗光宇

拟南芥F-box蛋白家族的功能研究进展魏春茹;李虎滢;田苗苗;于秀梅;刘大群【摘要】F-box proteins are a protein family containing F-box motif and in charge of recognizing the sub-strate to be degraded during ubiquitin-proteasome pathway.In order to promote the functional study of F-box family in A rabidopsis thaliana and other important crops ,and draw a complete metabolic network of the family in plants as soon aspossible ,the present paper focuses on the research progress of F-box family in A .thaliana reported in recent years ,including the amount ,type of member of F-box family and their roles during grow th and development ,cell signal transduction ,biotic and abiotic stress resistance and oth-er physiological processes .%F-bo x蛋白是一类含有F-bo x基序、在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质.该文对国内外近年来有关F-bo x家族在拟南芥中的数量、种类以及在生长发育、细胞信号转导、生物及非生物逆境胁迫等多种生理过程中的作用等方面的研究进展进行综述,以期促进该家族基因在拟南芥和其他重要农作物中的功能研究,尽快描绘出该家族在植物中的代谢网络图谱.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2017(037)011【总页数】9页(P2300-2308)【关键词】拟南芥;F-box蛋白;结构;功能【作者】魏春茹;李虎滢;田苗苗;于秀梅;刘大群【作者单位】河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001;河北省植物生理与分子病理学重点实验室河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;河北省植物生理与分子病理学重点实验室河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001;河北省植物生理与分子病理学重点实验室河北保定071001;河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心,河北保定071001;河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】Q753;Q789在真核生物中，泛素(ubiquitin, ub)介导的蛋白降解途径是许多生理过程调控的关键环节，这一降解途径称为蛋白的泛素化。

的抑制能力更强, 两者在 2.5－10 µmol.L－1 范围内差异 最为显著(图 1A)。在 2.5 µmol.L－1 MeIAA 浓度下, 拟
南芥幼苗下胚轴长约为 MS 培养基上的 10% 。在大于
2.5 µmol.L－1 的浓度下, MeIA A 对下胚轴的抑制程度随
浓度变化很小(图 1A )。综合上述两种现象, 我们选取
2 结果与分析
2.1 Me IAA抗性突变体筛选条件的确定
在进行大规模突变体筛选之前, 我们首先比较了 IA A 和
MeIA A 对黑暗下生长的拟南芥幼苗的下胚轴抑制程度。
在 0. 1－25 µmol.L－1 浓度范围内, 随着激素浓度的升高,
IA A 和MeIA A 对下胚轴的抑制程度都增强, 但是MeIAA
quljpkueducn拟南芥meiaa抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析北京大学生命科学学院北京大学耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验北京100101摘要生长素是最重要的植物激素之一参与了植物生长发育的各个方面
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 52−58, w w w
1.4 突变体温度转移实验 将种子表面消毒后, 铺在 MS 培养基上, 4°C 春化 2 天, 然后转到 22°C, 水平萌发 3 天。转移大约 20 棵小苗到 新的 MS 平板上, 共转移 2 块。将其中一块仍然放在 22°C 条件下, 另一块转至 29°C, 垂直培养 3 天。比较 2 个生长条件下的植株下胚轴长度, 并统计。
室温保存。
1.3 M eIAA抗性突变体的筛选
将表面消毒后的种子点播在含有 2.5 µmol.L－1 MeIA A

TGA 转录因子在植物氧化胁迫应答中的调控作用罗秀云;李园园;周赓;田云;卢向阳【摘要】综述了植物 TGA 转录因子的分类、结构和作用，介绍了 TGA 转录因子在植物 ROS 应答途径中的调控作用，对植物 TGA 转录因子的研究现状进行了总结，并对其未来的研究进行了展望。

%The classification,structure and function of TGA transcription factors in plant were reviewed. The regulatory function of TGA transcription factors in ROS responsing pathway of plant was introduced.The research status of TGA transcription factors in plant were summarized and the research in future was prospec-ted.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P1-5)【关键词】氧化胁迫;TGA 转录因子;信号转导途径【作者】罗秀云;李园园;周赓;田云;卢向阳【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128; 湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128; 湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128; 湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128; 湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128; 湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q78植物体内各组织器官（如根、茎、叶、花、果）时刻都在发生生理代谢，在代谢过程中会产生活性氧（ROS）。

拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备周茜;曹志林;俞俞;杨仲南【摘要】在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用.利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a.将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白.该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔.制备出的多克隆抗血清经ELISA 测定效价为1∶2560,Western blot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好.TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(039)002【总页数】6页(P175-180)【关键词】原核表达;拟南芥;转录因子;TDF1;融合蛋白;多克隆抗体【作者】周茜;曹志林;俞俞;杨仲南【作者单位】上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234;河南工程学院,资源与环境学院,郑州,451191;上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234;上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234【正文语种】中文【中图分类】Q511转录因子是指与靶基因启动子中的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对转录过程起激活或抑制作用的DNA结合蛋白.MYB家族转录因子以保守的DNA结合域为共同特征，是植物最大的转录因子家族之一，R2R3-MYB转录因子是植物中数目最多的一类MYB蛋白，其N-端都含有包含2个重复的螺旋-转角-螺旋的R2R3 DNA结合结构域［1，2］.花药是植物的雄性生殖器官，是花粉发育的场所.绒毡层在花药发育过程中起着至关重要的作用，它释放酶复合物降解胼胝质，提供花粉发育所必需的营养物质，并参与调控花粉外壁的形成［3］.TDF1基因编码了一个拟南芥细胞核定位的R2R3-MYB家族转录因子.在花药发育早期，该转录因子特异性地在绒毡层，花粉母细胞和小孢子中高效表达.该基因突变，绒毡层发育异常，其功能出现紊乱，导致花粉不能形成，突变体呈雄性不育表型［4］.但是在生化水平上，TDF1在花药发育中的具体功能还不清楚.抗体的制备是在生化水平上研究蛋白质功能的一个重要途径.根据制备的原理和方法，抗体可分为多克隆抗体，单克隆抗体和基因工程抗体，其中多克隆抗体的制备方法比较成熟，过程简单，因此被广泛应用.由于一种抗原有多个不同的抗原决定簇，B淋巴细胞克隆可以识别每一个抗原决定簇，并产生出针对它们的抗体，因此这种异种免疫血清中含有的抗体是多克隆抗体［5］.利用原核表达的蛋白免疫动物来制备多克隆抗体是一种十分有效的方法.在本研究中，克隆获得TDF1基因，并构建了原核表达载体TDF1-pET32a，将其转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG 诱导后在原核细胞中成功表达了这个蛋白.该融合蛋白主要以不溶的包涵体形式表达，以洗涤纯化溶解后的包涵体作为抗原免疫家兔，制备出了效价较高，特异性较强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础.1.1 试剂和材料1.1.1 质粒与菌株pMD18-T载体购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；原核表达载体pET-32a（+）购自北京鼎国生物技术有限公司；大肠杆菌感受态菌株DH5α及BL21（DE3）由本实验室提供.1.1.2 生物学试剂T4 DNA连接酶、限制性内切酶Sac I、Xho I和Prjmestar DNA聚合酶购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、dNTPs、PCR产物回收试剂盒、Trjs、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司；引物由Invjtrogen公司合成.1.2 方法1.2.1 TDF1基因的克隆参照GenBank中序列设计用于扩增TDF1基因的引物.上游引物序列为TDF1F∶5′-AAGAGCTCATGGGAAGACCTCCTTGTTG-3′，含有Sac I位点；下游引物序列为TDF1R∶5′-AACTCGAGATAATCGAAATCATTCAAGAGTTGA-3′，含有Xho I位点.以实验室现有的含TDF1基因的质粒［4］作为PCR模板.PCR反应体系为∶10×buffer 5×10-6L，dNTP Mjxture 5×10-6L（0.0025 mol/L），引物各1.5×10-6L（0.01 mol/L），模板1×10-6L，Prjmestar DNA聚合酶1×10-6L，去离子水补充体积至5×10-5L，反应条件为2步法∶94℃变性30 s，62℃退火及延伸1 mjn，35个循环；72℃10mjn.经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物，连接到pMD18-T载体（步骤参照TaKaRa公司说明书），转化至E.coli DH5α中，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上，37℃培养过夜.筛选出克隆后，挑取单菌落，提取质粒，用Sac I、Xho I限制性内切酶进行双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆进行测序（上海桑尼公司）.1.2.2 原核表达载体TDF1-pET32a的构建上述重组质粒TDF1-T用Sac I，Xho I于37℃消化5 h，经琼脂糖凝胶电泳，回收的TDF1片段与同样用Sac I，Xho I酶切的pET-32a载体进行连接，转化入感受态E.coli DH5α中，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上.挑取单菌落培养后抽提质粒，进行PCR和双酶切鉴定，保存重组质粒.1.2.3 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析鉴定正确的TDF1-pET32a质粒与空载体pET32a（阴性对照）分别转化表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态，涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜.挑取TDF1-pET32a和pET32a各一个单菌落分别于1 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜.各取5×10-5L菌液转至5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置37℃振荡培养2～4 h，至0D600为0.5～1.0，各取1 mL菌液放入离心管中，高速离心1 mjn，收集细菌沉淀（未经IPTG诱导）.剩余的菌液加入IPTG，至终浓度为0.001 mol/L进行蛋白诱导，在1 h，2 h，3.5 h，5 h 分别收集1 mL菌液，并测定其0D值，高速离心1 mjn，收集细菌沉淀.每管细菌沉淀按0D值大小加入适量的1×SDS蛋白加样缓冲液，置于100℃煮沸3 mjn，离心后取上清于12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳［6］.融合蛋白可溶性分析∶1 mL诱导菌液离心后，加入5×10-5L PBS重悬菌体，然后用液氮反复冻融十次，离心后分别收集上清跟沉淀，沉淀再以5×10-5L PBS重悬，进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白是以包涵体还是可溶蛋白形式存在.1.2.4 包涵体蛋白的可溶性处理及抗原制备包涵体蛋白的可溶性处理参照Kjrubakaran等［7］的方法，将包涵体用3倍体积的洗涤缓冲液（0.01 mol/L Trjs-HCl，pH 7.5，0.3 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，1%Trjton X-100和1 mol/L urea）清洗三次，每次4℃10000转离心10 mjn，然后包涵体沉淀溶解于10倍体积的溶解缓冲液（0.05 mol/L Trjs-HCl，pH 7.8；0.005 mol/L MgCl2；0.0025 mol/L 2-mercaptoethanol；0.1%（w/v）Tween 20；8 mol/L urea），在室温下孵育1 h.抗原制备∶纯化溶解后的包涵体上样进行SDS-PAGE电泳，PAGE胶用考马斯亮兰染色液染20 mjn后，再用脱色液脱色干净.用刀片切下56KD处的目的条带，放在干净的离心管中，加适量的PBS溶液，用磨棒碾碎备用.1.2.5 多克隆抗体制备及效价鉴定抗体制备∶取1 mL碾碎的包含抗原的PAGE胶与1 mL弗氏完全佐剂混匀后对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，10 d后用相同的碾碎的样品与1 mL弗氏不完全佐剂混匀，注射家兔.相同的实验再重复两次（后两次不加弗氏不完全佐剂），每次间隔10 d.最后一次注射一周后，对被免疫的兔子进行心脏取血，血液放37℃温育1 h，然后放4℃过夜，析出的血清加叠氮钠，分装后-20℃保存.用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体效价，免疫后的兔抗血清用PBS逐一按2倍稀释分别加入已包被抗原的反应孔中，以PBS做为阴性对照，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（1∶5000），用底物TMB显色，2 mol/L H2S04终止反应.用酶标仪在A450测定吸光值.1.2.6 Western blot检测Western blot检测∶将样品蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经电转仪转移到PVDF 膜上.将膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1.5 h，清洗后加入按1∶200稀释于TBST中的兔多克隆抗体，在摇床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 mjn 换一次清洗液.再加稀释于TBST中的HRP标记的羊抗兔IgG（1∶10000），在摇床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15mjn换一次清洗液.洗膜后加ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒.然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒，显影定影于X光胶片上.2.1 TDF1融合蛋白表达载体的构建以前期工作中构建的含有TDF1基因的质粒［4］为模板，利用上述引物，在高保真PrjmeStar聚合酶的作用下经PCR扩增得到大小为951 bp的TDF1基因（图1-A）.随后，将获得的TDF1基因克隆到pMD18-T载体，得到过渡载体TDF1-T.经限制性内切酶Sac I/Xho I消化后，电泳结果表明TDF1已成功克隆入pMD18-T（图1-B）.利用T载体上的M13通用引物进行测序分析，结果表明目的片段序列与Genbank数据库序列吻合.为了获得大量的TDF1蛋白，采用了原核表达的载体pET-32a（+）进行蛋白表达实验.用限制性内切酶Sac I和Xho I将过渡载体中TDF1片段切下后，将其克隆入pET-32a（+），转化E.coli DH5α感受态后的重组质粒用限制性酶切鉴定可以看到一条大约951 bp的条带（图1-C），测序结果表明目的基因TDF1位于正确的读码框中，获得了原核表达质粒TDF1-pET32a.将构建好的TDF1-pET32a及作为阴性对照的pET32a空载体转化入表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态中，PCR鉴定显示TDF1-pET32a含有目的基因片段（图1-D）.2.2 TDF1融合蛋白的原核表达预期的TDF1蛋白分子量为35.8KD［4］，pET32a质粒所带标签蛋白（Trx-Tag，Hjs-Tag及S-Tag）分子量为20.4KD（图2 B2），所以表达的TDF1与标签蛋白融合后分子量约为56.2KD.按照材料与方法中所述步骤进行蛋白诱导表达实验，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导1 h，2 h，3.5 h及5 h后，在56.2KD处可见TDF1重组蛋白的条带（图2 A2～A5）.此外，TDF1的蛋白表达量随诱导时间延长而逐渐增加（图2 A2～A5），表明TDF1重组蛋白能够在原核中稳定表达.2.3 融合蛋白可溶性分析SDS-PAGE电泳结果显示，诱导菌经液氮反复冻融后，上清液里几乎没有目的融合蛋白，而融合蛋白大部分都存在沉淀中，故诱导表达的TDF1重组蛋白主要是以不溶的包涵体形式表达（图3-3，3-4）.对包涵体进行洗涤纯化和溶解后，可以看到大部分的杂蛋白已被去除（图3-5），切胶富集融合蛋白包涵体后用于抗体制备.2.4 抗体的制备与检测溶解后的融合蛋白包涵体进行SDSPAGE电泳，切下的含有目的蛋白的PAGE胶碾碎后分4次注射家兔后，对家兔进行心脏取血，血液经37℃温育后，低温放置过夜析出多克隆抗血清.多抗经ELISA实验测定效价，因底物是TMB，故用酶标仪在A450测定吸光值.计算样本0D值与对照0D值的比值P，P大于等于2.1为阳性，小于2.1大于1.6为可疑，小于1.6为阴性.实验数据见表1，当抗血清稀释至2560倍的时候，P值为2.6，为阳性，稀释到5120倍的时候，P值为1.6，结果不可信，而稀释到更高倍数时，P值小于1.6了，表现为阴性.故实验结果表明抗血清效价为1∶2560.为了进一步分析获得的抗体对TDF1蛋白的识别，用Western blot技术检测抗体.杂交后经HRP标记的羊抗兔显色试剂盒显色，用X光胶片显影，在胶片上可在目的蛋白56.2KD处看到清晰的条带，这表明多克隆抗体与目的蛋白识别良好（图4）.本研究利用分子生物学技术克隆了TDF1基因，并逐步构建到原核表达载体pET32a中.诱导表达结果显示，构建的原核表达载体TDF1-pET32a经IPTG诱导后，TDF1融合蛋白以包涵体的形式得到了高效稳定的表达.产生的包涵体是高密度，不溶性的蛋白表达产物，它的形成使目的蛋白的分离纯化变得更为容易.先前的研究表明，包涵体经过洗涤后可以去除可溶的，粘附的细菌蛋白.多数情况下，调整洗涤的条件可使包涵体中外源蛋白的纯度达到90%以上，从中提取的蛋白可以直接用作抗原［6］.故而在本实验中将包涵体先用含1 mol/L尿素的缓冲液清洗多次，尽可能除去菌液中含有的可溶性的杂蛋白，清洗后的包涵体再用含8 mol/L浓度尿素的缓冲液在室温下溶解，这样处理后的包涵体内外源蛋白被溶解，离心后存在于上清里.经SDSPAGE电泳后可以看到大部分杂蛋白已经被去除，用刀片切下56KD左右的目的蛋白可以做为抗原免疫家兔.对获得的多克隆抗血清经Western blot技术检测，结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好.R2R3-MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、器官的形成、植物叶片的形态建成及抗病具有重要的调节作用［8］.然而对于MYB转录因子TDF1作用位点及下游基因的研究并不清楚.虽然可以采用CASTjng的策略寻找转录因子的DNA结合位点［9，10］，染色质免疫共沉淀（Chromatjn Immunoprecjpjtatjon，ChIp）的方法可以用来在体内鉴定转录因子直接调控的下游基因.但是这些方法都需要特异性很高的蛋白抗体［11］.本研究制备的抗体与目的融合蛋白TDF1特异性较强，可用于TDF1作用位点及其直接调控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究TDF1在花药发育中的分子机理.【相关文献】［1］ R0MER0 I，FUERTESA，BENIT0 M J，et al.More than 80 R2R3-MYB regulatory genes jn the genome of Arabjdopsjs thaljana［J］.Plant J，1998，14（3）：273-284. ［2］ BIEDENKEPPH，B0RGMEYER U，SIPPEL A E，et al.Vjralmyb oncogene encodes a sequence-specjfjc DNA-bjndjng actjvjty［J］.Nature，1988，335（6193）：835-837. ［3］ PACINIE，FRANCHIG G，HESSE M.The tapetum：jts form，functjon，and possjble phylogeny jn Embryophyta［J］.Plant Syst Evol，1985，149：155-185.［4］ ZHU J，CHEN H，LIH，et al.Defectjve jn Tapetal Development and Functjon 1 js essentjal for anther development and tapetal functjon formjcrosporematuratjon jn Arabjdopsjs［J］.Plant J，2008，55（2）：266-277.［5］巴德年.当代免疫学技术与应用［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.［6］萨姆布鲁克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南（第3版）［M］.黄培堂，译.北京：科学出版社，2002.［7］ KIRUBAKARAN S I，SAKTHIVEL N.Clonjng and overexpressjon of antjfungal barley chjtjnase gene jn Escherjchja colj［J］.Protejn Expr Purjf，2007，52（1）：159-166.［8］ MARTIN C，PAZ-ARES J.MYB transcrjptjon factors jn plants［J］.Trends jn Genetjcs，1997，13（2）：67-73.［9］ WRIGHTW E，BINDER M，FUNKW.Cycljc ampljfjcatjon and selectjon of targets （CASTjng）for themyogenjn consensus bjndjng sjte［J］.Mol Cell 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