检测牛IFN_双抗体夹心ELISA建立及在牛结核病诊断上的初步应用_张改梅(2014 第一)

畜牧兽医学报

２０１４，４５（１０）：１６９３－１６９８

Ａｃｔａ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ　ｅｔ　Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ

ｄｏｉ：１０．１１８４３／ｊ．ｉｓｓｎ．０３６６－６９６４．２０１４．１０．０１６

检测牛ＩＦＮ－γ双抗体夹心ＥＬＩＳＡ的建立及

在牛结核病诊断上的初步应用

张改梅１＃，贾　红１＃，侯绍华１，鑫　婷１，郭晓宇１，袁维峰１

，

刘淑清１，吴　竞１，高新桃２，李　明１，董瑞凯１，朱鸿飞１＊

（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；２．中国农业科学院研究生院，北京１０００８１）

摘　要：本研究旨在建立牛ＩＦＮ－γ

体外释放法，为牛结核病的免疫学诊断提供一种快速、有效的新检测技术。分别

以获得的牛ＩＦＮ－γ单克隆抗体Ｂｏ－ｍＡｂ１作为捕获抗体，以Ｂｏ－ｍＡｂ

２Ｈ作为检测抗体，建立了基于双抗体夹心

ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）的牛ＩＦＮ－γ体外释放法。该方法的最低检出限为３．１２ｎｇ·ｍＬ－１，可特异性检测出重组牛

ＩＦＮ－γ（Ｂａｃ－ＢｏＩＦＮ－γ）及天然ＢｏＩＦＮ－γ，而与猪、犬、鸡的天然ＩＦＮ

－γ

无交叉反应。批内、批间变异系数小于

５．１１％

。

临床检测结果显示，与结核菌素皮内变态试验（ＴＳＴ）、进口ＢｏｖｉｇａｍＴＭ试剂盒检测的符合率分别为８８．７％和９５．３％。结果表明，

ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法具有良好的敏感性、特异性及精确度，可用于临床样品的检测，为监测牛结核病

特别是其早期感染提供了强有力的检测技术手段。关键词：牛结核病；ＩＦＮ－γ；双抗体夹心ＥＬＩＳＡ；

临床诊断

中图分类号：Ｓ８５５．２；Ｓ８５４．４３ 文献标志码：Ａ 文章编号：０３６６－６９６４（２０１４）１０－１６９３－０６

收稿日期：２０１４－０３－１３

基金项目：国家８６３计划项目（２０１２ＡＡ１０１３０２）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（２０１４ｙｗｆ－ｚｄ－１

）；中国农业科学院科技

创新工程（ＡＳＴＩＰ－ＩＡＳ

－１１

）

作者简介：张改梅（１９９０－），女，山西阳泉人，硕士，主要从事动物疫苗与分子疫苗的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｉｍｅｉ０８０９＠１２６．ｃｏｍ，

＃共同第一作者，在本

研究中承担同等量的研究工作，共享第一作者＊通信作者：朱鸿飞（１９６５－），研究员，博士生导师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｉｏｃｌｕｂ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｄｏｕｂｌｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｂｏｖｉｎｅ　ＩＦＮ

－γ

ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ

ＺＨＡＮＧ　Ｇａｉ－ｍｅｉ　１＃，ＪＩＡ　Ｈｏｎｇ１＃，ＨＯＵ　Ｓｈａｏ－ｈｕａ１，ＸＩＮ　Ｔｉｎｇ１，ＧＵＯ　Ｘｉａｏ－ｙｕ１，ＹＵＡＮ　Ｗｅｉ－ｆｅｎ

ｇ

１，

ＬＩＵ　Ｓｈｕ－ｑｉｎｇ１，ＷＵ　Ｊｉｎｇ１，ＧＡＯ　Ｘｉｎ－ｔａｏ２，ＬＩ　Ｍｉｎｇ１，ＤＯＮＧ　Ｒｕｉ－ｋａｉ　１，ＺＨＵ　Ｈｏｎｇ－ｆｅｉ

１＊

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＣＡＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　Ｂｏｖｉｎｅ　ＩＦＮ－γＲｅｌｅａｓｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ

ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｎｅｗ，ｒａｐｉｄ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｔｕ－

ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ＩＦＮ－γｒｅｌｅａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ

（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ，Ｂｏ－ｍＡｂ１ａｇａｉｎｓｔ　ｂｏｖｉｎｅ　ＩＦＮ－γｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃａｐｔｕｒｅ

ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄ　ＨＲＰ－ｌａｂｅｌｅｄ　Ｂｏ－ｍＡｂ２Ｈａｓ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｏｕｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅ－

ｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ＥＬＩＳＡ　ｗａｓ　３．１２ｎｇ·ｍＬ－１．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｄｅｔｅｃｔ　ｂｏｖｉｎｅＩＦＮ－γｂｏｔｈ　ｆｒｏｍ　ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｈｏｗｉｎｇ　ｎｏ　ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｏｒｃｉｎｅ，

ｃａｎｉｎｅ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ＩＦＮ－γ．Ｔｈｅ　ｉｎｔｒａ－ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒ－ａｓｓａｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｗｅｒｅｂｏｔｈ　ｗｉｔｈｉｎ　５．１１％．Ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ　ｓｋｉｎ　ｔｅｓｔ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＢｏｖｉｇａｍＴＭｋｉｔ，ｏｕｒ　ｐｒｅ－

ｌｉｍｉｎａｒｙ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　８８．７％ａｎｄ　９５．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｓａ　ｒｅｓｕｌｔ，ａ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃａｎ　ｂｅ　ｍａｄｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｓ　ｇｏｏｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ畜　牧　兽　医　学　报４５卷　

ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｃｙ，ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ａｐｐｌｙ　ｔｏ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｌａｒｇｅ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｏｕｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃｏｎ－

ｔｒｉｂｕｔｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｏｖｉｎｅ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＩＦＮ－γ；ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ；ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ

牛结核病是一种主要由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人畜共患传染病［１］。目前，国内外用于诊断牛结核病的检测方法大体分为三类，如细菌学检测、分子生物学技术及免疫学检测［２］。其中免疫学检测方法中，结核菌素皮内试验（ＴＳＴ）是ＯＩＥ规定的金标准，然而其敏感性和特异性不尽如人意，主观性较强，难以区分环境分枝杆菌，易出现假阳性［３］。近年来，体外ＩＦＮ－γ释放试验以其高特异性和灵敏度的优势，日益受到本领域学者们的关注［４－５］。机体感染牛分枝杆菌后，体内的淋巴细胞被牛分枝杆菌抗原致敏，再次接触该抗原时被致敏的淋巴细胞会释放相对大剂量的ＩＦＮ－γ，用免疫学方法可以检测出ＩＦＮ－γ，但用ＰＰＤ刺激未感染的牛淋巴细胞时，其并不释放ＩＦＮ－γ，有专家预测ＩＦＮ－γ释放试验将成为２１世纪诊断牛结核病的最新诊断试验方法［６］。Ｐ．Ｒ．Ｗｏｏｄ等利用针对ＢｏＩＦＮ－γ的单克隆抗体，建立了一种基于全血培养的ＩＦＮ－γ释放方法［７］，用于奶牛结核病的诊断，经数万例临床试验证明效果良好［８－９］，表明体外ＩＦＮ－γ释放试验可以作为理想的ＴＳＴ的补充试验［３，８－９］，但进口的ＢｏｖｉｇａｍＴＭ牛ＩＦＮ－γ检测试剂盒价格昂贵，制约了其在中国的大规模使用，而中国还没有商品化的牛ＩＦＮ－γ检测试剂盒出售，因此作者基于实验室已制备的牛ＩＦＮ－γ单克隆抗体建立双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，并进行了临床的初步应用及与常规方法的比较，为牛结核病的诊断提供了快速、敏感的检测方法。１　材料与方法１．１　材料抗牛ＩＦＮ－γ的单抗Ｂｏ－ｍＡｂ１和Ｂｏ－ｍＡｂ２、辣根过氧化物酶标记Ｂｏ－ｍＡｂ２（Ｂｏ－ｍＡｂ２Ｈ）、重组牛ＩＦＮ－γ（Ｂａｃ－ＢｏＩＦＮ－γ）由本实验室制备并保存；ＰＰＤ－Ｂ、ＰＰＤ－Ａ及ＢｏｖｉｇａｍＴＭ试剂盒购自北京测迪公司；ＧｕａｒｄｉａｎＴＭＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ、洗板机和酶标仪均为Ｔｈｅｒｍｏ公司产品。Ｓｕｒｅｂｌｕｅ　Ｒｅ－ｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ为ＫＰＬ公司产品。１．２　临床样品奶牛抗凝血采自陕西和山东某牛场；健康的猪、北京油鸡抗凝血采自北京畜牧兽医研究所昌平基地养殖场；健康的犬抗凝血采自北京某动物医院体检的博美犬。１．３　

方法

１．３．１　检测样品的制备及阴阳性对照品的确定　

　Ｂａｃ－ＢｏＩＦＮ－γ经ＨｉｓＴｒａｐ　ＦＦ纯化后进行纯度分析，并采用ＢＡＣ试剂盒定量。将Ｂａｃ－ＢｏＩＦＮ－γ作为阳性对照品，澳洲小牛血清作为阴性对照品。由牛尾静脉采血至肝素锂抗凝管中，２４ｈ内分至２４孔细胞板中，１．５ｍＬ·孔－１，每份血样分别用ＰＰＤ－Ｂ、

ＰＰＤ－Ａ和ＰＢＳ刺激，１００μＬ·孔－１，３７℃ＣＯ２

孵

育２０～２４ｈ，３　５００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ

，收集上清，

采用ＢｏｖｉｇａｍＴＭ试剂盒检测。根据ＢｏｖｉｇａｍＴＭ试剂盒检测值将样品分为强阳性、中等阳性、弱阳性及阴性（ＯＤ４５０ｎｍ≥２．０判为强阳性，１．０≤ＯＤ４５０ｎｍ＜２．０

判为中等阳性，０．２≤ＯＤ４５０ｎｍ＜１．０判为弱阳性，

ＯＤ４５０ｎｍ＜０．２判为阴性）。于－８０℃保存备用。１．３．２　Ｂｏ－ｍＡｂ１和Ｂｏ－ｍＡｂ２

识别表位分析

采用相加指数法进行分析，按照白昀等的方法进行［１０］。按照如下公式计算叠加率（ＡＩ）：ＡＩ＝［

Ａ

１＋２

－Ａ１］／Ａ２×１００％。公式中

Ａ

１为ｍＡｂ１的ＯＤ４５０ｎｍ

值，Ａ２为ｍＡｂ２的ＯＤ４５０ｎｍ值，Ａ１＋２为ｍＡｂ１叠加

ｍＡｂ２的ＯＤ４５０ｎｍ值，当ＡＩ＞１０％时，表明这２株单抗所识别的抗原位点不同，若ＡＩ≤１０％时，表明这２株单抗所识别的抗原位点相近或相同。１．３．３　双抗体夹心ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）最佳反

应条件优化１．３．３．１　

捕获抗体的包被质量浓度优化：用碳酸盐

缓冲液（ｐＨ９．６）稀释捕获抗体Ｂｏ－ｍＡｂ

１

，分别梯度

稀释为１０

、５、２．５和１．２５μｇ·ｍＬ－１，

１００

μＬ·孔－１，４℃包被过夜；ＰＢＳＴ洗涤６次，加入封闭液进行封闭，２００μＬ·孔－１；

洗涤后加入检测样

品，按１∶１稀释，１００μＬ·孔－１，３７℃作用１ｈ，

同

时以５ｎｇ·ｍＬ－１的Ｂａｃ－ＢｏＩＦＮ－γ作为阳性对照，澳洲小牛血清作为阴性对照。洗涤后加入工作浓度的酶标记抗体Ｂｏ－ｍＡｂ