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华南地区黑色素瘤癌基因突变谱分析

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中国肿瘤临床2014年第41卷第21期ChinJClinOncol2014,Vol.41,No.21www.cjco.cn

华南地区黑色素瘤癌基因突变谱分析*

周启明①张星②丁娅②彭瑞清②颜淑梅③张晓实②

摘要目的：研究华南地区黑色素瘤的癌基因突变谱，为黑色素瘤分子靶向治疗策略的优化提供理论依据。方法：本研究收集中山大学肿瘤防治中心2000年3月至2009年4月黑色素瘤病理组织蜡块86例，其中肢端黑色素瘤28例、黏膜黑色素瘤28例、非慢性阳光损伤型黑色素瘤30例，采用Sequenom平台（OncoCartaPanelv1.0和MassARRAY体系）研究黑色素瘤癌基因的突变谱。结果：有38.4%（33/86）的黑色素瘤病灶可见基因突变，突变的基因包括：BRAF（16.3%）、NRAS（10.5%）、KIT（5.8%）、EGFR（4.7%）、HRAS（2.3%）、KRAS（2.3%）、MET（2.3%）和PIK3CA（1.2%）。其中BRAF突变型患者与野生型相比发病年龄早

［（45.7±15.3）岁vs.（55.9±12.7）岁，P=0.01］，NRAS突变型患者与野生型相比溃疡表现率高（88.9%vs.48.1%，P=0.049）。结论：本研究是对华南地区黑色素瘤癌基因突变谱的综合分析，有利于进一步指导华南地区黑色素瘤的个体化治疗。关键词黑色素瘤癌基因突变

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.20132055·基础研究·

黑色素瘤（melanoma）恶性程度高、侵袭力强，对

化疗极不敏感。近年来使用BRAF抑制剂治疗晚期

黑色素瘤取得了显著的疗效［1-2］。但是同高加索人相

比，中国人黑色素瘤BRAF基因突变频率不高［3］，迫

切需要发现更多有效的治疗靶点。因此，本研究收

集了不同部位的黑色素瘤病理组织标本，采用Seque⁃nom平台（OncoCartaPanelv1.0和MassARRAY体系）（Sequenom，SanDiego，CA，USA）进行高通量基因突

变分析，为优化中国人黑色素瘤分子靶向治疗策略

提供更多依据。

1材料与方法1.1研究对象

本研究收集中山大学肿瘤医院2000年3月至2009年4月手术切除的90例黑色素瘤患者的病理组OncogenicmutationprofilesinvolvedinmelanomainSouthernChina

QimingZHOU1,XingZHANG2,YaDING2,RuiqingPENG2,ShumeiYAN3,XiaoshiZHANG2Correspondenceto:XiaoshiZHANG;E-mail:zhangxsh@sysucc.org.cn1DepartmentofOncology,theSixthPeople'sHospitalofShenzhen(NanshanHospital),Shenzhen518052,China;2MelanomaUnit&BiotherapyCenter,3DepartmentofPathology,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.ThisworkwassupportedbytheMedicalResearchFoundationofGuangdongProvince(No.A2013618)andShenzhenNanshanScientificPlanningProjects(No.2012009).AbstractObjective:ToexaminetheoncogenicmutationsinvolvedinmelanomainSouthernChinaandtoprovideatheoreticalbasisforthedevelopmentofmelanomamoleculartargetedtherapystrategy.Methods:TheSequenomplatform(OncoCartaPanelv1.0andMassARRAYSystem)wasusedtodeterminetheprevalenceofoncogenemutationsin28acralmelanomasamples,28mucosalmel-anomasamples,and30non-chronicsun-induced-damage(no-CSD)melanomasamplesfromSouthernChina.Results:Atleastonemu-tationwasdetectedin33ofthe86melanomas(38.4%)withmutationsobservedinBRAF(16.3%),NRAS(10.5%),KIT(5.8%),EGFR(4.7%),HRAS(2.3%),KRAS(2.3%),MET(2.3%),andPIK3CA(1.2%).InBRAF,theageofpatientswithmutationswassignificantlylowerthanthosewithoutBRAFmutation(45.7±15.3vs.55.9±12.7,P=0.01).PatientswithmutationsinNRASweremorelikelytohaveulcerationcomparedwithpatientswithoutNRASmutations(88.9%vs.48.1%,P=0.049).Conclusions:Thisstudyrepresentsacompre-hensiveandconcurrentanalysisofthemajorrecurrentoncogenicmutationsinvolvedinmelanomacasesfromSouthernChinaareas.Thedatahaveimplicationsforbothclinicaltrialdesignsandtherapeuticstrategies.Keywords:melanoma,oncogene,mutation

作者单位：①深圳市第六人民医院（南山医院）肿瘤科（深圳市518052）；②中山大学肿瘤防治中心生物治疗中心；③中山大学肿瘤防治中心病理科􀆽本文课题受广东省医学科研基金项目（编号：A2013618）和深圳市南山区科技计划项目（编号：2012009）资助

通信作者：张晓实

zhangxsh@sysucc.org.cn1343中国肿瘤临床2014年第41卷第21期ChinJClinOncol2014,Vol.41,No.21www.cjco.cn

织蜡块标本：肢端黑色素瘤（acralmelanoma）、黏膜黑

色素瘤（mucosalmelanoma）（全部来源于鼻咽部和鼻

窦黏膜）、非慢性阳光损伤型黑色素瘤（melanomaonskinwithoutchronicsun-induceddamage，non-CSD）各

30例。同时了收集患者的相关临床资料，包括：发病

年龄、性别、TNM（tumour-node-metastases）分期及有

无溃疡。本研究已通过院伦理委员会审批并严格遵

守《赫尔辛基宣言》的相关原则。1.2癌基因突变分析

本研究采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒

（QIAamp公司）进行DNA提取。DNA的质量通过检

测其光密度值（opticaldensity，OD）及进行1%琼酯糖

凝胶电泳来验证。采用Sequenom平台（OncoCartaPanelv1.0和MassARRAY体系）（Sequenom，SanDiego，

CA，USA）进行基因突变分析。Sequenom平台可以同

时分析常见的19个基因的238个热点（ABL1，AKT1，AKT2，BRAF，CDK4，EGFR，ERBB2，FGFR1，FGFR3，

FLT3，JAK2，KIT，MET，HRAS，KRAS，NRAS，PDGFRA，

PIK3CA和RET）（见http：//www.sequenom.com）。实验

操作包括4个步骤：1）DNA的扩增：将全基因组DNA

（10ng/μL）、OncoCartaPCR引物及PCR扩增试剂按2∶2∶1容积比在384孔PCR平板中配制成每孔最终容

量为5μL的反应体系，PCR扩增，反应条件为：初始

变性94°C2min；94°C30s，56°C30s，72°C1min，45

个循环；72°C延伸5min；2）SAP（Shrimpalkalinephosphatase）反应：将SAP混合试剂每孔2μL加入至

上述384孔PCR平板，在PCR仪中行SAP反应，使残

留在扩增反应混合物中的游离脱氧核苷酸去磷酸

化，以免干扰下一步的反应。反应条件为：37°C40min，85°C5min，1个循环；3）引物延伸反应：将Type⁃

PLEX延伸反应混合剂每孔2μL加入至上述384孔

PCR平板，在PCR仪中行延伸反应，检测扩增后的

DNA中插入、缺失、置换及其它多态性。反应条件

为：初始变性94°C30s；94°C5s，（52°C30s，80°C3s，5个循环），40个循环；72°C延伸3min；4）延伸产物的

去盐反应及质谱分析：在含有最终反应样本的384孔PCR平板中每孔加入6mg树酯以达到去盐的目的；

通过MassARRAYNanodispenserS（Samsung）将反应

产物点样到SpectroCHIPⅡ基质芯片上，使用基质辅助

激光解析/离子化时间飞行质谱议（MALDI-TOFMS，Sequenom，SanDiego，California）进行基因突变分析，并

使用MassArrayTyperAnalyzer软件4.0.4.20（Seque⁃nom，SanDiego，California）进行数据分析。

1.3统计学分析

本研究采用SPSS13.0软件进行统计学分析。分类变量用频率和百分比来描述，连续变量例如发病

年龄用x±s来描述。分类变量采用Fisher确切概率

法或χ2检验，连续变量采用t检验。所有分析中，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

在90例病理标本中有2例肢端黑色素瘤及2例

黏膜黑色素瘤由于未能提取质量满意的DNA而未纳

入研究，最后有86例黑色素瘤病例进入分析（表1）。2.1黑色素瘤的癌基因突变分析

在本研究中，有38.4%（33/86）的黑色素瘤病灶可

出现基因突变（表2），突变的基因包括：BRAF，NRAS，HRAS，KRAS，KIT，EGFR，MET和PIK3CA。

其中BRAF突变分别见于14.3%（4/28）的肢端黑色素

瘤，7.1%（2/28）黏膜黑色素瘤和26.7%（8/30）非慢性

阳光损伤型黑色素瘤，其中BRAFV600E占78.6%

（11/14）。NRAS突变分别见于7.1%（2/28）肢端黑色

素瘤，14.3%（4/28）黏膜黑色素瘤和10%（3/30）非慢

性阳光损伤型黑色素瘤，其突变集中在密码子12

（G12A，G12C，G12D），密码子12（G13R）和密码子61

（Q61H，Q61K，Q61L，Q61R）。KIT突变见于3.6%（1/28）肢端黑色素瘤，10.7%（3/28）黏膜黑色素瘤和

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NRAS突变的黑色素瘤分子机制研究进展

NRAS突变的黑色素瘤分子机制研究进展

NRAS突变的黑色素瘤分子机制研究进展

作者：陈德高

来源：《科技视界》 2013年第20期

陈德高

(四川大学 华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041)

【摘 要】NRAS突变的黑色素瘤中有一些经典的信号通路，与肿瘤的发生和发展密切相关。该肿瘤细胞内信号机制得到了深入研究。

【关键词】黑色素瘤；NRAS；突变

黑色素瘤恶性程度很高，早期就可发生转移。世界卫生组织调查显示全球每年大概有5万人死于黑色素瘤。

1 黑色素瘤中NRAS的发现

RAS家族有三种成员：NRAS、HRAS、KRAS。在正常情况下，RAS蛋白基本上都与GDP结合在一起，定位在细胞质膜内表面上。在人类大多数肿瘤中存在着RAS的突变，黑色素瘤中主要是NRAS突变。

研究者们对黑色素瘤细胞进行基因分析时发现了NRAS突变。NRAS、KRAS、HRAS在所有黑色素瘤中的突变率分别为20%、2%、1%[1]。但是目前不清楚NRAS在黑色素瘤中突变率高于HRAS和KRAS的原因。大于50%的黑色素瘤中存在BRAF突变，在剩下将近50%的BRAF野生型患者中存在着15-20%的NRAS突变。

2 NRAS突变的黑色素瘤细胞内信号机制

正常黑色素细胞内，MAPK信号通路内的RAS介导活化的是BRAF而不是CRAF。这种构型的选择是腺苷酸环化酶活化所致。腺苷酸环化酶活性增强，导致cAMP堆积和PKA活化，使得CRAF的两个抑制性位点（S43和S233）磷酸化而失活[2]。

但在NRAS突变的黑色素瘤细胞中BRAF被CRAF替代。这主要基于两种机制：NRAS突变的黑色素瘤细胞中BRAF的失活（RAF构型选择）和PKA活性异常（阻止CRAF失活）[3]。前者是因为MAPK通路中ERK活化后，BRAF的S151、T401、S750和T753位点磷酸化，BRAF失活。S151位点与RAS结合域相关，其磷酸化后会阻止RAS与BRAF的结合，T401、S750以及T753磷酸化后，BRAF与CRAF的二聚体化被打破。后者是因为cAMP降解酶（磷酸二酯酶Ⅳ）表达增加，限制了PKA的活性，阻止了CRAF的两个抑制性位点磷酸化。

HIF-1α_纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用

HIF-1α_纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用

山西农业科学 2023，51（12）：1435-1441Journal of Shanxi Agricultural Sciences

HIF-1α纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用

李佳敏 1，贾琼 1，秦蓉芬 1，迟志端 1，王富明 2，范瑞文 1

（1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801；2.晋中市庄子乡综合便民服务中心，山西 晋中 030600）

摘要：缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）参与低氧微环境相关疾病的发生等过程，具有控制肿瘤生长和发展的功能。黑色素瘤是一种发生于人和动物恶性程度较高的肿瘤。为探明HIF-1α纳米抗体对黑色素瘤的影响，研究利用前期保存的羊驼源黑色素瘤细胞噬菌体文库筛选HIF-1α纳米抗体，经原核表达与纯化后，通过Western Blot和免疫组织化学验证HIF-1α纳米抗体与抗原的结合性；分别通过CCK-8法、划痕试验以及Western Blot法检测其对B16黑素瘤细胞的增殖和迁移能力及其相关分子表达的影响。结果表明，经表达和纯化获得的HIF-1α纳米抗体分子质量约为16 ku，没有跨膜结构，具有亲水性。通过Western Blot和免疫组织化学验证了其具有良好的抗原结合性。在增殖试验和划痕试验中，与对照组相比，HIF-1α纳米抗体抑制了B16细胞的增殖和迁移，下调了靶基因VEGF的表达，并使细胞增殖和迁移相关蛋白Ras、ERK、RAC和RAF的表达量下调。预测HIF-1α纳米抗体进入B16细胞内，与抗原结合，通过下游靶基因VEGF下调RAs、ERK、RAC、RAF的表达，从而对细胞增殖和迁移起抑制作用，可作为黑色素瘤治疗的新靶点。关键词：HIF-1α；纳米抗体；B16细胞；Western Blot法；CCK-8法；细胞增殖；细胞迁移中图分类号：R739.5 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）12‒1435‒07

MDA—MB-435细胞系起源于黑色素瘤

MDA—MB-435细胞系起源于黑色素瘤

中华乳腥病杂志（电子版）２０１２年４月第６卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｄｉｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｒｉｌ　２０１２，Ｖｏ１．６．Ｎ０．２　

ＭＤＡ—ＭＢ－４３５细胞系起源于黑色素瘤　

欧周罗　

ＭＤＡ—ＭＢ４３５是美国得克萨斯大学ＭＤ　

Ａｎｄｅｒｓｏｎ癌症中心Ｃａｉｌｌｅａｕ等¨　建立的一个细胞　

系，来自患转移性乳腺导管腺癌的３１岁高加索女　

性的胸腔渗出液，一直被视为乳腺癌细胞而广泛　使用。ＭＤＡ—ＭＢ－４３５细胞系在美国典型培养物保　

藏中心（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）的　

编号为ＨＴＢ．１２９。截止２０１２年２月２０　Ｅｔ，仅从　ＰｕｂＭｅｄ的“Ａｂｓｔｒａｃｔ”检索入口以“ＭＤＡ．ＭＢ－４３５”　

和“ｂｒｅａｓｔ”为检索词进行检索，就可检索到７７８篇　

文献，但越来越多的证据表明它其实来自黑色素　

瘤，看来乳腺癌研究者应该对ＭＤＡ—ＭＢ－４３５道别　了。　

目前，国内外可用的乳腺癌细胞系至少有　

１１２种，包括人乳腺癌细胞系８６种、小鼠乳腺癌　细胞系２０种和大鼠乳腺癌细胞系６种。然而，既　

能在免疫缺陷动物身上长出肿瘤又能自发性转移　

的人乳腺癌细胞系并不多。其中ＭＤＡ—ＭＢ－４３５似　

乎最具有攻击性，它能在无Ｔ细胞的ＢＡＬＢ／ｃ裸　

小鼠或Ｔ、Ｂ细胞皆无的ＳＣＩＤ小鼠身上迅速长出　

肿瘤，自发性肺转移率可达４０％，迄今尚无出其　

右者，难怪多年来深受器重，甚至有些学者一提起　

乳腺癌细胞系首先想到的就是它，几乎没有学者　怀疑过它的身世，问题恰恰就出在了这里。２０００年　

著名的《自然・遗传学》杂志发表了美国斯坦福大　

学Ｒｏｓｓ等的重要论文。Ｒｏｓｓ等　采用基因芯片　技术对美国国立癌症研究所筛选抗癌药的６０种　

常用癌细胞系进行了８０００种基因的扫描分析，结　

果显示ＭＤＡ—ＭＢ－４３５居然表达与黑色素瘤相关的　

基因，由此指出那位乳腺癌患者可能同时存在隐　

2010年黑色素瘤(GMTF)临床进展

2010年黑色素瘤(GMTF)临床进展

责编：龙华电话：（010）64036988-329E-mail：longh@版式：罗建国美编：冷姗思黑色素瘤临床治疗进展

——2010GMTF中国黑色素瘤论坛北京站报道肿瘤B92010年9月23日星期四

郭军教授作为CSCO黑色素瘤专家委员会主任委员，介绍了亚洲黑色素瘤流行病学特点、转移性黑色素瘤治疗进展和我国治疗经验及成果。郭军教授指出，亚洲人黑色素瘤发病特点与欧美白种人存在明显差异。首先，病理类型不同，亚洲人肢端和黏膜黑色素瘤发病率高达70%，而在白种人中仅占5%左右；其次，亚洲人原发黑色素瘤病灶的厚度明显厚且多伴有溃疡；再次，前者的基因变异主要集中于CKIT和BRAF，而后者更多表现为BRAF突变。对于转移性黑色素瘤的治疗，化疗仍以达卡巴嗪和替莫唑胺为主，虽有效率只有8%~15%，但仍是金标准。生物化疗虽能提高反应率，却不能改善生存，借用Eggermont教授的话说已是“远去的记忆”。多药联合（如Dartmouth或CVD方案）被证实增毒不增效。目前取得突破性进展的药物是今年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上报道的新药Ipilimumab。它通过阻断Treg细胞膜表面的CT⁃LA-4，调动T细胞介导的抗肿瘤免疫，达到杀伤肿瘤目的，被定义为靶向免疫治疗，是近10余年来被证明能延长晚期黑色素瘤患者生存的首个药物。在个体化靶向治疗中，针对BRAF和CKIT的靶向药物已在黑色素瘤治疗中取得了令人振奋的结果。如针对黑色素瘤BRAF（V600E）突变的药物能达到约70%的有效率。另外，我国首次在ASCO年会报道伊马替尼（格列卫）治疗CKIT变异的多次治疗失败晚期黑色素瘤，能达到60%的疾病控制率。这也引起国际黑色素瘤学术界的关注。对于晚期黑色素瘤，先进行基因筛查，再选择治疗可能更有利于患者获益。黑色素瘤治疗正呈现出如孙燕院士所说“同病异治，异病同治”的趋势。（北京大学肿瘤医院斯璐根据郭军教授报告整理）2010年9月12-14日，国际黑色素瘤专家委员会（GMTF）中国黑色素瘤论坛在上海、北京、广州三地举行。这次论坛通过国内外专家的交流，解析国际黑色素瘤最新信息、进展与临床研究结果，解读黑色素瘤诊治指南与规范，为亚洲黑色素瘤治疗提供了新思路。在9月13日北京站论坛中，孙燕院士作为特邀会议主席，荷兰伊拉姆斯大学肿瘤中心艾格蒙特（AlexanderM.M.Eggermont）教授，德国基尔大学豪席尔德（AxelHauschild）教授，澳大利亚悉尼大学医学院校长、附属韦斯特米德（westmead）医院院长、癌症研究所所长科福尔德（RickKefford）教授及北京大学肿瘤医院郭军教授分别就黑色素瘤流行病学和治疗进展做了大会报告，现整理如下，以飨读者。