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猪β干扰素的基因改造与酵母分泌表达
Gene Modification and Secretive Expressing of Porcine IFN-β
In Yeast Pichia Pastoris
一、DNA抽提
取猪（杜长大三元杂）肝脏100mg于匀浆器中，加入500μl DNA抽提裂解缓冲液Ⅰ后充分研磨，倒入EP管，再加1μl蛋白酶K（20mg/ml），56℃水浴4小时，煮沸5min灭活蛋白酶K，冰浴5min。
加入等体积酚-氯仿，旋涡振荡1min使之充分混匀后静置10min ，12,000g离心10min ，取上清，重复加酚-氯仿抽提，离心后取上清，再于上清液中加入等体积异丙醇，旋涡混匀，静置10min 后12,000g离心10min 。
弃上清，加入1ml75%乙醇，7，500g离心10min。
弃酒精，真空干燥5min，加入50μl双蒸水溶解所抽提DNA。
二、PCR扩增及基因定点突变
模板DNA5μl
10x PCR buffer 5μl
dNTP 4μl
Blen Taq 0. 5μl
引物1 (IFNPM1) 1μl
引物2 (IFNPM2) 1μl
H2O 33.5μl
50μl
94℃2min ; 94℃30s, 55℃30 s, 72℃40s; 30cycles ; 72℃10min。
PCR产物的回收纯化，按OMEGA DNA纯化试剂盒进行。
纯化产物进行Xba I 和ECoR I双酶切
体系：
IFN-β/ IFN-βser176μl
10X Buffer M 2μl
Xba I 1μl
ECoR I 1μl
ddH2O 10μl
Total：20μl
37℃3h
扩大酶切体系，胶回收纯化酶切产物－20℃保存备用
三、pPIC zαC质粒的抽提
1.钩取菌种划线于含25μg/ml Zeocin低盐LB平板，37℃过夜培养。
2.挑单菌落于含25μg/ml Zeocin低盐LB试管，37℃过夜振荡培养。
3. 抽提质粒（采用OMEGA质粒抽提试剂盒）。
4.用ECoR I、Xba I酶切，电泳检测。
体系：
pPIC zα C 10μl
10X Buffer M 2μl
Xba I 1μl
ECoR I 1μl
ddH2O 6μl
Total 20μl
5.扩大酶切体系，胶回收纯化双酶切产物，－20℃保存备用
四、IFN-βser17 与pPIC zαC的连接
体系：
IFN-β ser17 6μl
pPIC zα C 4μl
T4连接酶 1μl
10X buffer 2μl
ddH2O 7μl
total 20μl
16℃过夜连接
五、连接产物的转化
（一）DH5а感受态细胞的制备：
1．挑取-20℃保存的DH5а单菌落接种于3ml的LB液体培养基中，37℃160r/min培养过夜（此为一级培养）
2．将一级培养菌液接2%的量接种于5ml新鲜LB液体培养基中，37℃，200r/min,培养2.5~3.0h，使细菌进入对数生长期。
（OD600=0.6左右）
3．将二级培养产物分装到1.5ml离心管，冰浴30min.
4. 1500g，4℃离心10min,弃上清。
5．加750ul0.1mol/l冷CaCL2液悬浮菌体。
6．1500g ，4℃，10min，弃上清，加入80ul预冷的CaCL2（0.1mol/l）重悬菌体。
7. 制备好的感受态可以冰浴过夜（或直接用于转化或加无菌甘油（15-20%）―70℃长期保存。
（二）转化
(1)取连接产物5μL加入到80μL的感受态细胞悬液中，小心轻轻吹匀，冰浴30min，另取(2)100μL的感受态细胞不加质粒作空白对照。
(3)42℃热休克90s后，迅速冰浴5min。
(4)加入900μL LB培养基，37℃摇床上作150rpm，90min。
(5)取上述菌液100μL涂布在上述准备好的25μg/ml Zeocin低盐LB固体培养基上，置37℃的温箱中放置30min，菌液吸附完全，然后倒置培养10-12h。
Low Salt LBMedium with Zeocin.
10 g Tryptone
5 g NaCl
5 g Yeast Extract
1. Combine the dry reagents above and add deionized, distilled water to 950 ml. Adjust
pH to 7.5 with 1N NaOH. Bring the volume up to 1 liter. For plates, add 15 g/L agar
before autoclaving.
2. Autoclave on liquid cycle at 15 psi and 121°C for 20 minutes.
3. Allow the medium to cool to at least 55°C before adding the Zeocin. to 25μg/ml
final concentration.
4. Store plates at +4°C in the dark. Plates containing Zeocin. are stable for up to 2
weeks.
（三）挑菌及PCR鉴定
与转化菌平板中挑取单菌落到含25μg/mL Zeocin低盐LB的2ml 离心管中，37℃振荡培养6－8小时，做PCR 鉴定。
体系：
菌液0.5μl
10x PCR buffer 2.5μl
dNTP 2μl
Blen Taq 0.25μl
IFN1 2.5μl(0.25μM)
IFN2 2.5μl(0.25μM)
H2O 14.75μl
25μl
94℃2min ; 94℃30s, 50℃30 s, 72℃40s; 30cycles ; 72℃10min。
电泳检测
送样测序证明克隆的片段无误后进行下一步工作。
