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(整理)传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养.

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精品文档 实验二 传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的

了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类

BHK-21：仓鼠肾传代细胞

PK-15：猪肾传代细胞

IBRS-2：猪肾传代细胞

Hela：人的子宫瘤细胞

Vero：非洲绿猴肾细胞

Marc-145：来源于Vero细胞

TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞

Sf9：昆虫细胞

三、材料

1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头

2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞

3、0.25%胰酶

4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 精品文档

精品文档 5、伪狂犬病病毒液（PRV）

四、传代细胞培养的条件要求

1）细胞密度：2-3×105个/ml

2）pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3）培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

五、常用细胞分散剂与作用原理

1、胰酶 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶 ：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液

1、人工综合营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清

1）血清的种类

胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2）血清的处理 精品文档

精品文档 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。

3）血清的作用

A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。

E、给培养液提供良好的缓冲系统。

F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。

4）应用血清存在的问题

A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。

B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。

C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。

七、传代细胞系培养

1、优点：1) 可以无限的传代。

2) 不少细胞系对病毒很敏感。

3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。

3、培养方法 精品文档

精品文档 1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。

2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。

3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。

八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养

1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。

2、加入适量的病毒悬液

3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。

4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。

5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。

实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）

一、实验目的

了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。

二、材料

1、9-11日龄鸡胚

2、照蛋灯与蛋座 精品文档

精品文档 3、碘酊棉球与酒精棉球

4、大剪子、眼科剪、小镊子

5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、

6、胰酶、生长液、维持液

三、细胞培养的条件要求

1）细胞密度

原代细胞：4-6×105个/ml

传代细胞：2-3×105个/ml

2）pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3）培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

四、操作步骤

1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。

2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。

3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。

4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。 精品文档

精品文档 6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。

7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。

8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。

9、细胞计数

取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。

按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。

活细胞数应在90%以上。

10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。

○表示可计数

●表示不计数 精品文档

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五、结果的观察

于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。

实验四 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测

半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 精品文档

精品文档 半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶

2、胰酶、吸球、吸管、生长液

3、96孔细胞培养板

4、加样器、枪头

5、病毒液（PRV）

四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。

3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）

5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法

五、TCID50的计算方法

1、Reed-Muench两氏法

病毒液稀释度 出现CPE孔数 无CPE孔数 累 计 出现CPE孔所占的% CPE孔数 无CPE孔数 精品文档

精品文档 10-1 8 0 27 0 100（27/27）

10-2 8 0 19 0 100（19/19）

10-3 7 1 11 1 91.6 （11/12）

10-4 3 5 4 6 40（4/10）

10-5 1 7 1 13 0.7（1/14）

10-6 0 8 0 21 0（0/21）

CPE：Cytopathic effect

距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）

＝（91.6-50）/（91.6-40）

＝ 0.8

lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数

=0.8×(-1)+(-3)

=-3.8

TCID50=10-3.8/0.1ml

含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

2、Karber法

病毒液稀释度 出现CPE的孔数 出现CPE孔的比率

10-1 8 8/8=1

10-2 8 8/8=1

10-3 7 7/8=0.875

10-4

3

3/8=0.375

10-5 1 1/8=0.125

10-6 0 0/8=0

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细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏

1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。

2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。

3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。

4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。

5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。

6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。

7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。

细胞冻存及复苏：

细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。

细胞冻存及复苏的步骤如下：

1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。

2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。

3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。

4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。

细胞培养

细胞培养

细胞培养接种病毒的应用及进展

摘要：病毒不具有细胞结构，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，对抗生素具有明显的抵抗力，而且缺乏完整的酶系统，不具备能量合成系统，也不具有核糖体，是绝对的细胞内寄生。以上特点表明：病毒必须在活的组织细胞中才能正常生长，通过细胞病变的观察来判断病毒的增殖。这样看来体外细胞培养就显得尤其重要。

关键词：病毒、细胞培养、接种病毒

病毒只具有一种类型的核酸[1]（DNA或RNA），并且只能在宿主细胞内通过复制的方式进行繁殖，形状大体上分为三种：球形颗粒、杆状颗粒和复杂形状颗粒。病毒必须在活的组织细胞中生长繁殖，因此病毒培养的宿主系统主要有实验动物、鸡胚、体外培养的器官和组织细胞。

与传统的鸡胚接种相比，利用体外动物细胞培养[2]的方法具有很多优势，如抗原匹配性好，能够实现大规模生产和自动化控制，可以在短时间内使病毒大量增殖，解决疫苗制备中的很多难题，减少过敏反应等。

1 体内、外细胞的差异和分化

差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化，关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

2 细胞的分类

根据细胞培养物的生长类型：粘附细胞和悬浮型细胞

细胞传代培养实验报告

细胞传代培养实验报告

细胞传代培养实验报告

一、实验目的：

1.了解细胞传代培养的基本原理；

2.学习细胞传代培养技术的操作方法；

3.掌握细胞传代培养实验的基本步骤和注意事项；

4.获得细胞传代培养实验的经验和技能。

二、实验原理：

细胞传代培养是指从初始培养物中取出一部分细胞并重新分散、传代到新的培养基中。通过连续传代，细胞数量可以维持并增加，同时可以获得较为纯净的细胞系，以满足细胞实验的需要。传代细胞时，需要注意细胞的密度，培养基的补充和细胞培养的条件等。

三、实验材料与方法：

1.材料：

-细胞培养物

-培养基

-无菌离心管、培养皿、吸管、移液器等实验器材

2.方法：

-准备工作：消毒实验器材和台面，准备培养基和培养物；

-取出细胞培养物，离心采样管； -收集细胞，用无菌移液器将细胞转移到新的培养基中；

-细胞传代，将细胞分散在新的培养基中；

-转移细胞至新的培养皿中；

-增加培养基，继续培养细胞；

-观察细胞生长情况，记录数据。

四、实验结果与分析：

1.细胞的形态：观察细胞的外形和颜色，是否有异常；

2.细胞的数量：通过显微镜或细胞计数板计算细胞的数量；

3.细胞的增长速度：根据前几代的细胞数量和时间，计算细胞的增长速率；

4.观察细胞的附着情况和细胞分裂情况；

5.记录实验结果。

五、实验结论：

通过本次实验，我们成功进行了细胞的传代培养实验。观察细胞的外形和数量变化，我们可以得出以下结论：

1.细胞在新的培养基中可以继续生长和繁殖，实现了细胞传代培养的目标；

2.细胞数量随着传代次数的增加而增加，细胞的增长速率相对稳定；

3.细胞形态正常，没有明显的异常；

4.在培养的过程中，细胞附着情况较好，细胞分裂正常。 六、实验心得：

通过本次实验，我学到了细胞传代培养的基本原理和操作技巧。我了解了细胞的培养条件和细胞的要求，掌握了细胞传代培养的步骤和注意事项。在实验中，我注意保持实验器材的无菌，尽量减少细菌的污染。同时，我也学会了如何观察细胞的形态和数量变化，以及如何记录实验结果。通过这次实验，我更加了解了细胞传代培养的重要性和应用范围，对于日后的细胞实验和研究具有很大的帮助。

传代细胞的培养与观察实验报告

传代细胞的培养与观察实验报告

传代细胞的培养与观察实验报告

一、实验目的

1、 掌握传代细胞的培养方法和操作技巧。

2、 学习细胞计数和细胞生长曲线的绘制。

3、 观察传代细胞在不同培养条件下的形态变化和生长特点。

二、实验原理

细胞培养是指在体外模拟体内环境，使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。传代细胞培养则是将原代培养的细胞经过一定的处理后，转移到新的培养容器中继续培养的过程。

细胞在培养过程中，需要适宜的营养物质、生长因子、气体环境和温度等条件。通过定期观察细胞的形态、数量和生长状态，可以了解细胞的生长规律和特性。

三、实验材料与设备

1、 细胞株：HeLa 细胞（人宫颈癌细胞）

2、 培养基：DMEM 培养基（含 10%胎牛血清、1%双抗）

3、 试剂：胰蛋白酶、PBS 缓冲液

4、 仪器设备：CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、细胞计数板等 四、实验步骤

1、 细胞复苏

从液氮罐中取出冻存的 HeLa 细胞，迅速放入 37℃水浴中解冻。待细胞完全解冻后，将其转移至离心管中，加入适量的培养基，轻轻混匀，然后在 1000 rpm 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入新鲜的培养基，重悬细胞，将细胞接种到培养瓶中，置于 CO₂培养箱中培养。

2、 细胞传代培养

当细胞生长融合至 80%－90%时，进行传代培养。首先，吸出原培养瓶中的培养基，用 PBS 缓冲液冲洗细胞 2 次。然后，加入适量的胰蛋白酶，使其覆盖细胞表面，放入培养箱中消化 1-2 分钟。在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆、间隙增大时，立即加入含血清的培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其从培养瓶壁上脱落，形成细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，在 1000 rpm 条件下离心 5

分钟。弃去上清液，加入新鲜的培养基，重悬细胞，并按照适当的比例将细胞接种到新的培养瓶中，置于 CO₂培养箱中继续培养。

3、 细胞计数

使用细胞计数板对细胞进行计数。首先，将细胞悬液充分混匀，然后吸取适量的细胞悬液加入细胞计数板的计数室中。在显微镜下观察计数室中的细胞，按照计数规则进行计数。计数完成后，根据公式计算细胞浓度。