利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定

利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1. 了解微生物分子鉴定的原理和应用。

2. 掌握利用16S rRNA基因进行微生物分子鉴定的操作方法。

3. 运用软件构建系统发育树并对微生物进行系统发育关系分析。

【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。

但这些传统手段均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。

随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应( PCR) 技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR 指纹图、rRNA 基因（即rDNA）指纹图、16S 核糖体核糖核酸（ribosomal RNA，rRNA）序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA 片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

其中原核生物16S rRNA 基因（真核18S rRNA 基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。

核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。

其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。

在16S rRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。

其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16S rRNA基因片段扩增出来，测序获得16S rRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16S rRNA基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的目的。

通常认为，16S rRNA基因序列同源性小于97 %，可以认为属于不同的种，同源性小于93~95 %，可以认为属于不同的属。

系统进化树（系统发育树）是研究生物进化和系统分类中常用的一种树状分枝图形，用来概括各种生物之间的亲缘关系。

通过比较生物大分子序列（核苷酸或氨基酸序列）差异的数值构建的系统树称为分子系统树。

系统树分有根树和无根树两种形式。

无根树只是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不反映进化途径。

而有根树不仅反映生物类群之间的系统发育关系，而且反映出它们有共同的起源及进化方向。

分子系统树是在进行序列测定获得分子序列信息后，运用适当的软件由计算机根据各微生物分子序列的相似性或进化距离来构建的。

计算分析系统发育相关性和构建系统树时，可以采用不同的方法如基于距离的方法[UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小进化法）]、NJ（Neighbor-Jioning，邻接法）、MP （Maximum Parsimony，最大简约法）、ML（Maximum Likelihood，最大似然法）和贝叶斯（Bayesian）推断等方法。

构建进化树需要做Bootstrap检验，一般Bootstrap值大于70，认为构建的进化树较为可靠。

如果Bootstrap值过低，所构建的进化树的拓扑结构可能存在问题，进化树不可靠。

一般采用两种不同方法构建进化树，如果所得进化树相似，说明结果较为可靠。

常用构建进化树的软件有Phylip、Mega、PauP、T-REX等。

本实验以枯草芽孢杆菌的鉴定为例，应用16S rRNA基因序列分析技术进行微生物鉴定的实验。

【实验用品与仪器】1．菌种和质粒（1）菌种：枯草芽孢杆菌，E.coli DH5（2）质粒：pMD18-T载体2．培养基LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1L，pH 7.2。

3．试剂和溶液琼脂糖、细菌基因组提取试剂盒、dNTP、DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA 连接酶、X-gal、IPTG、限制性内切酶SpH I和Pst I等。

4．仪器设备及其他PCR仪、电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、超净工作台、摇床、电子天平、恒温培养箱等。

【实验内容】1．设计合成引物使用16S rRNA全长通用引物。

引物1：5′-AGAGGTTGATC CTGGCTCAG-3′；引物2：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

提交基因合成公司合成。

2．PCR扩增16S rRNA基因片段以基因组DNA为模板，最适量为0.1~1.0 ng，过多可能引发非特异性扩增，过少可能扩增失败PCR体系一般用25 L，使用保真度较高的DNA聚合酶。

反应体系：模板1μL引物1 0.5 μL引物2 0.5 μLdNTP(10mM) 0.5 μLTaq酶（5U/ml）0.5 μL10×PCR buffer 2.5μL灭菌水至25μLPCR反应：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30个循环。

72 ℃ 10 min。

4 ℃存放。

3．琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物配制1 %琼脂糖凝胶，取4 μL PCR产物，混合0.5 μL l 6×上样缓冲液加样，DL2000 Marker作为分子量标准，在1×TAEk ，110V电泳45~60min，EB染色，紫外凝胶成像仪中观察。

16S rRNA基因片段大约为1.5 kb。

4．胶回收16S rRNA基因片段（1）电泳配制1 %低熔点琼脂糖凝胶，将PCR获得的16S rRNA基因与上样缓冲液混合，加入到一大的胶孔中。

4 ℃，50 V恒压电泳2~3 h。

（2）切胶紫外灯下，用无菌刀片切下条带转移至干净的1.5 mL 离心管中。

（3）胶回收1）准确称量凝胶的重量，按1g≈1m L计，加入5倍体积的TE缓冲液，盖上盖子，于65 ℃保温5 min融化凝胶。

2）待凝胶冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚（pH 8.0），剧烈振荡混匀20 s。

20 ℃，10000 r/min 离心10 min，回收水相。

3）加入等体积的酚：氯仿（pH 8.0的Tris饱和酚与氯仿等体积混合），剧烈振荡，20 ℃，10000 r/min 离心10 min，回收水相。

4）用等体积的氯仿抽提上清，颠倒混匀，20 ℃，10000 r/min 离心10 min，回收水相。

5）将水相移到一新的1.5 mL离心管，加入0.2倍体积的10 mol/l 乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀后在室温下放置20 min。

然后于4 ℃，12000 r/min离心10 min，弃上清，找开管盖，晾干沉淀，将沉淀溶解在一定量的无菌双蒸水中备用。

5．16S rRNA基因片段通过pMD18-T载体进行克隆（1）16S rRNA基因片段与pMD18-T载体连接在0.5 mL的微量离心管中分别加入以下溶液，16 ℃连接过夜（12~14 h）。

pMD18-T载体100 ng胶回收的16S rRNA基因50 ngT4 DNA连接酶 1 μL2×连接缓冲液 5 μL无菌双蒸水至10 μL（2）转化将连接好的载体在冰上放置5 min，然后全部加入到装有200 μL E.coli DH5 a感受态细胞的微量离心管中，用预冷的移液枪头轻轻混匀，置于冰上5 min。

然后在42 ℃水浴热击90 s，迅速将离心管转移到冰上，放置5 min。

将转化细胞转移到10 mL无菌试管中，加入1 mL 37 ℃预热的LB培养基，37 ℃，200 r/min振荡培养1h。

（3）重组子的筛选将上述培养液涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上，37 ℃恒温培养过夜，出现白色菌落一般是重组子。

（4）重组子的酶切鉴定挑取几个白色菌落，分别接种到含有终浓度100 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。

用碱法提取转化子质粒。

用限制性内切酶Sph I和Pst I，37 ℃酶切2~3 h。

将酶切产物加样到1 %琼脂糖凝胶进行电泳，观察1.5 kb左右的酶切条带，证明是正确的重组子。

6．16S rRNA基因的序列测定将验证正确的重组子交给专业测序公司完成测序。

7．序列分析与系统发育树的构建（1）相似序列的获取用BLAST生物信息数据库搜索功能进行在线相似性搜索，选择几个已知分类地位的相似序列。

（2）多重序列比对分析用Clust X软件对多个相似序列进行多重序列比对分析。

（3）构建系统发育树利用Mega 4软件构建系统发育树。

（4）系统发育关系分析【实验结果与分析】1．将PCR扩增的凝胶电泳结果扫描图打印出来，并对结果加以分析说明。

2．对重组子筛选平板上的菌落特征进行描述和分析。

3．对PCR产物进行测序所得的序列进行序列特征分析。

4．对基于16S rRNA基因的序列构建的系统发育树进行系统发育关系分析。

【思考题】1．16S rRNA基因的序列有什么特征？2．利用16S rRNA基因序列分析方法获得的鉴定结果与菌株已知的分类结果是否一致？若不一致，如何确定其准确的分类地位？附录：用Mega 4构建系统发育树的过程1. 利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)数据库搜索程序获得16S rRNA相似序列登录到有BLAST服务的网站，如美国国立生物技术信息中心NCBI（http://blast.ncbi.nlm. /Blast.cgi）。

进入BLAST主页界面，选择nucleotide blast（blastn），把要搜索的DNA 序列以FASTA格式粘贴到Search栏，Database选项选择Others，点击BLAST，得到result of Blast，选项中序列以FASTA格式保存。

>错误!未找到引用源。

gb|HQ185400.1| Stenotrophomonas maltophilia strain 5633 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=1540Score = 2663 bits (1442), Expect = 0.0Identities = 1457/1464 (99%), Gaps = 1/1464 (0%)Strand=Plus/PlusBlastn结果中参数含义：Score是指提交的序列和搜索出的序列之间的分值，越高说明越相似；Expect（E值）是指比对的期望值，比对越好E值越小，一般在核酸的比对，E值小于1e-10，比对就算是很好，多数情况下为0；Identities是指提交的序列和参比序列的相似性，如上所指序列为1464核苷酸中二者有1457个相同；Gaps指的是对不上的碱基数目；Strand为链的方向，Plus/Minus指的是提交的序列与参比序列是反向互补的，如果是Plus/Plus 则二者皆为正向。